Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 40

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 34 35 36 37 38 39 < 40 > 41 42 43 44 45 46 .. 239 >> Следующая

Г. Аминокислотный анализ
Исследования с помощью аминокислотного анализатора Biotronik (модель LC 6000 Е) с детектированием по ортофта-левому диальдегиду (Benson, Hare, 1975) показали, что степень чистоты карбоангидразы Б равна 77,3% (по массе; средний результат из четырех измерений).
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
107
III. РАЗДЕЛЕНИЕ ПО РАЗМЕРУ: ГЕЛЬ-ПРОНИКАЮЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
А. Введение
Первые разделения биополимеров методом ВЖХ были осуществлены на гель-проникающих колонках с применением разнообразных подвижных фаз, включая денатурирующие растворители (Regnier, Noel, 1976; TSK Gel Bibliography, 1983). Проверка семи имеющихся в продаже носителей для ВЖХ показала, что при белковых нагрузках более 100 мкг и использовании подвижных фаз с ионной силой 0,1—0,6 М и pH 6—7 выход белка составляет более 85% (Pfannkoch et al., 1980).
Б. Реагенты и условия элюции
Колонки: сначала Ultropac TSK Gel 3000 SW, 7,5X600 мм, а затем Ultropac TSK Gel 2000 SW, 7,5X600 мм (Ultropac — зарегистрированная торговая марка LKB, Бромма, Швеция; TSK Gel — зарегистрированная торговая марка Toya Soda Mfg. Co., Япония).
Подвижная фаза: 10 мМ трис-НС1, 0,15 М NaCl, pH 7,0,
0,05%-ный полиэтиленгликоль 6000 (ПЭГ 6000) (все реактивы Merck, Дармштадт).
Элюция: изократическая
Скорость потока: 1 мл/мин
Выявление: по поглощению при 280 и 205 нм
Стандарты. Перед хроматографией колонки калибровали, нанося 10 мкг каждого из следующих стандартов: тироглобу-лина (мол. масса 669 000, выходит в свободном объеме); бычьего сывороточного альбумина (БСА) (мол. масса 67 000); овальбумина (мол. масса 45000; Pharmacia); карбоангидра-зы Б (мол. масса 30 000; Sigma 4396); апомиоглобина (мол. масса 17 200; Beckman 339182); апротинина (мол. масса 6000; Serva 13718); 3Н20 (полный объем колонки; New England Nuclear).
Примечания. При последовательном использовании двух колонок можно увеличивать нагрузку, а разрешение при этом улучшается. ПЭГ 6000 добавляют в подвижную фазу для того, чтобы избежать адсорбции белков на поверхностях при разделении разбавленных растворов (Stanley, Guilbert, 1981). ПЭГ 6000 в концентрации <0,1% не изменяет линейного соотношения между логарифмом молекулярной массы и объемом элюента, в котором выходят с колонок стандартные белки.
Подвижную фазу готовили на дистиллированной воде, которую пропускали через патрон NORGANIC (Millipore). Перед
108 Глава 6
30 40
Объем элюата мл
120
90
- 0,0-1
0.03
0.02
-0,01
Гель-проникающая ВЖХ 45 кДа 30 кДа 17 кДа
I II
q,5 *Да
I
Рис. 6-1. Очистка МГФР с помощью гель-проникающей хроматографии на тандемной системе колонок (60 см) TSK G3000 SW и TSK G2000 SW. Поднижная фаза: 10 мМ трис-НС1, pH 7,0, 0,15 М NaCl, 0,05%-ный ПЭГ 6000. Стрелками указаны положения овальбумина, карбоангидразы Б, миоглобина и апротинина (мол. массы этих белков равны 45, 30, 17 и 6,5 кДа соответственно). Исходным образцом для этого разделения послужил препарат, полученный после семи последовательных этапов хроматографии из 20 л среды, кондиционированной клетками WEHI-3B (D-). Горизонтальным отрезком указаны фракции, стимулирующие рост гранулоцитов, макрофагов и эритроцитов (ГМЭ), что соответствует 460 нг белка по данным поглощения при 205 нм.
использованием раствор фильтровали через фильтр GSWP (0,22 мкм; Millipore) для удаления частиц и сведения к минимуму бактериального загрязнения в последующих биологических тестах.
В. Использование для очистки
и характеристики МГФР
Для определения молекулярной массы и очистки МГФР использовали тандемную систему колонок TSK с ПЭГ 6000 в составе подвижной фазы, разделяющую белки по размерам (Iscove et al., 1982). На рис. 6-1 показан профиль элюции 460 нг МГФР с удельной активностью 4,7-105 ед./мг и мол. массой 30 000—35000.
Г. Аналитический вариант
При ВЖХ с разделением по размерам молекул снижение выхода и невоспроизводимость миграции белка из-за взаимодействия матрицы с жидкой фазой — явления довольно обыч-
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
109
ные. Они обусловлены остаточным отрицательным зарядом и гидрофобными свойствами, присущими всем имеющимся в продаже матрицам (Pfannkoch et al., 1980). Проблемы, возникающие из-за взаимодействий раствора с поверхностью наполнителей колонок, еще более осложняются, если учитывать влияние формы макромолекул на определение молекулярной массы. В связи с этим приходится признать, что получить точные значения молекулярной массы при гель-проникающей хроматографии довольно трудно. Альфредсон и др. (Alfredson et al., 1982) и Ренье (Regnier, 1983) обсуждают различные параметры матриц, анализируя которые можно объяснить неидеальное фракционирование. По их мнению, для разделения белков по размерам можно рекомендовать носитель TSK Gel 3000 SW, причем в тех случаях, когда ВЖХ используется только для разделения белков, недостатки этого метода могут оказаться даже полезными.
Предыдущая << 1 .. 34 35 36 37 38 39 < 40 > 41 42 43 44 45 46 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed