Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
21 мкг активного интерферона из лейкоцитов человека с использованием четырех последовательных этапов ВЖХ, стало ясно, что малые количества биологически активных белков можно с успехом хроматографировать на имеющихся в продаже ВЖХ-носителях. ВЖХ использовали также для очистки других интерферонов (Menge, Kula, 1984; Rinderknecht et al.,
1984). С 1979 г. носители для колонок были в значительной степени улучшены, что подробно обсуждается в обзоре Ренье (Regnier, 1983).
ВЖХ обеспечивает большую скорость разделения, воспроизводимость, чувствительность и является более универсальным приемом, чем традиционные хроматографические методы. В настоящее время с помощью ВЖХ можно проводить микроаналитические разделения на уровне пикомолей (Stein, Udenfriend,
1984), аналитические разделения на уровне наномолей (Alvarez et al., 1981), а также полупрепаративное фракционирование
11 В отечественной литературе ее также называют жидкостной хроматогра фией при высоком давлении (ЖХВД). — Прим. ред. перев.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
105
на уровне 1—10 мкмоль соединений с мол. массой от 100 до 1 000 000. В настоящее время разрабатываются препаративные варианты ВЖХ при разделении более чем 10 мкмоль белка для использования на экспериментальных заводах и для массового производства (Symposium Abstracts, 1984).
В этой главе мы рассмотрим способы характеристики с помощью ВЖХ пикомольных количеств биологически активных белков, получаемых с колонок для микроанализа, и обсудим аналитические и полупрепаративные варианты ВЖХ, используемые при очистке веществ. Мы остановимся также на примерах использования ВЖХ для сравнительного биохимического анализа небольших количеств практически неочищенного исходного материала и для получения нанограммовых количеств биологически активных белков при четырех вариантах разделения. Будут сопоставлены методы количественного определения белков при ВЖХ с помощью прямых измерений оптической плотности и другие стандартные методы. Особое внимание мы уделим вопросам чувствительности ВЖХ, специальным приемам, предназначенным для приготовления растворителей и образцов, и мерам, необходимым для сохранения биологической активности разделяемых веществ. На одном из примеров мы увидим, как высокоочищенный препарат получают при использовании нескольких последовательных этапов ВЖХ. Будут рассмотрены также некоторые неверные концепции, касающиеся перспектив применения ВЖХ для получения ряда биологически активных веществ.
П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
А. Оборудование
Эксперименты проводили на двухкомпонентной системе ВЖХ (Waters Associates, Кенигштайн, ФРГ), включающей два насоса М6000 с программируемым устройством подачи растворителя (модель 660), или на трехкомпонентной системе (Spectra Physics, модель 8700, Базель, Швейцария). Обе системы оснащены инжектором U6K фирмы Waters с петлей для образца объемом 2 мл, детектором с фиксированной длиной волны 280 нм (Waters, модель 440) и детектором с изменяемой длиной волны (ячейка с оптическим путем 1,5 см; UVIKON LC 720, Kontron, Базель, Швейцария), установленным на 205 нм. Спектральный диапазон дейтериевой лампы 180—370 нм. Все растворители постоянно дегазировали гелием для предупреждения образования пузырьков в системе.
Для того чтобы скорректировать различия в значениях «мертвого» объема для двух систем, градиенты увеличиваю-
106 Глава 6
щихся концентраций органического растворителя или солей контролировали, измеряя проводимость элюата (кондуктометр типа CDM2e, Radiometer, Копенгаген, Дания) при «прогоне» без введения образца. Значения проводимости переводили в величины процентного содержания органического растворителя или молярности солевого раствора с помощью калибровочных кривых. Фракции собирали на коллекторе RediRac (LKB, Бром-ма, Швеция).
Результаты хроматографии регистрировали на самописце W+W (модель 312) или использовали систему хранения и поиска данных, включающую компьютер Apple II (программа Нормана Н. Искова) и самописец W+W (модель 316) с системой DATASYN.
Б. Матрицы для колонок
Многие из использованных в описанных экспериментах наполнителей могут быть заменены другими имеющимися в продаже сорбентами на основе соединений кремния [спецификации и производящие фирмы приведены в обзоре Ренье (Reg-nier, 1983)], но при этом необходимо убедиться, что они являются эквивалентными по составу, размерам частиц и пор.
В. Определения биологической активности
Детальные описания тестирования биологической активности мультилинеарного гемопоэтического фактора роста (МГФР; Iscove et al., 1982), мышиного эритропоэтина, эритропоэтино-подобного фактора роста (Fagg, Roitsch, 1985), фактора, заменяющего В-клетки, колониестимулирующего фактора (КСФ) и интерлейкина-2 (ИЛ-2) (Corbel, 1983) приведены в соответствующих работах. В этой главе названия биологически активных белков даны в соответствии с номенклатурой, предложенной в обзоре по гемопоэтическим факторам роста (Iscove, 1985), или так, как их приводят авторы цитируемых работ.
