Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
2. Очистка дезоксирибонуклеотидов
Если длина цепи олигонуклеотида короче 15 звеньев, то суммарный препарат незащищенного олигонуклеотида разводят в нескольких миллилитрах 0,05 М триэтиламмонийбикарбоната (ТЭАБ) и фильтруют через силиконированную стеклянную вату. Раствор наносят в колонку с ДЭАЭ-сефадексом А25 и смесь элюируют градиентом возрастающей концентрации ТЭАБ (0,05—1,4 М, по 500 мл). Центральная часть сходящего с колонки пика продукта синтеза имеет чистоту >90% по анализу методом ВЖХ на колонке Bondapak С18 с использованием градиента ацетонитрила в 0,1 М ацетате триэтиламмония.
Если длина цепи олигонуклеотида более 15 звеньев, то суммарный препарат незащищенного олигонуклеотида разводят в
0,1 М ТЭАБ, фильтруют через силиконированную стеклянную
102 Глава 5
вату и наносят на колонку с сефадексом G-50. Первый пик, регистрируемый на УФ-детекторе, содержит все более длинные фрагменты. Материал, соответствующий этому пику, упаривают. Количество нуклеотидного препарата, соответствующее примерно 0,5 оптической единицы, разводят в 10 мкл красителя с мочевиной и наносят на одну дорожку 20%-ного полиакриламидного геля (соотношение акриламид: бисакриламид 19:1, размеры геля 40X20X2 см). После электрофореза извлекают гель и помещают его на тонкую, покрытую флуоресцентным красителем пластинку; нуклеотидные полосы выявляют в ультрафиолете. Полосу, отвечающую нужному олигонуклеотиду, вырезают, экстрагируют 0,1 М ТЭАБ, а затем обессоливают фильтрацией на короткой колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.
3. Материалы
Носитель из стекла с порами контролируемого размера [№ 24875; НКП; алкиламинная группировка с длинной алифатической цепью, диаметр пор 500 А, размер частиц 125—
127 мкм (Pierce)]
Пробирки с навинчивающимися крышками на 3,5 мл, № 13019 (Pierce)
Тетразол (Fluka); необходимо сублимировать Кизельгель Н для тонкослойной хроматографии (Fluka) Стеклянный фильтр (поверхностное покрытие № 3, 30 г/м2) Все упаривания производят при температуре <30°С Тетрагидрофуран (ТГФ)
Ацетонитрил Дихлорэтан, хлороформ N-Метилимидазол
Защищенные нуклеотиды и реагенты для связывания для обоих методов синтеза могут быть получены из различных источников.
IV. РЕАГЕНТЫ И РАСТВОРИТЕЛИ,
КОТОРЫЕ НЕОБХОДИМО ОЧИЩАТЬ ИЛИ ГОТОВИТЬ
Ацетонитрил: кипятят с обратным холодильником и перегоняют над фосфорным ангидридом, кипятят над СаНг и перегоняют непосредственно перед использованием Тетрагидрофуран: фильтруют через основной оксид алюминия, кипятят и перегоняют над натрием непосредственно перед использованием Дихлорэтан, хлороформ: хлороформ (р.а.; чистый для анализа) фильтруют через основный оксид алюминия (10 г на 14 мл хлороформа)
Методические подходы к синтезу олигонуклеотидов
103
Диоксан: фильтруют через основный оксид алюминия, кипятят и перегоняют с UAIH4, хранят над молекулярными ситами 4А в плотно закрытых флаконах Пиридин: кипятят и перегоняют с тозилхлоридом, кипятят над гидридом кальция, хранят над молекулярными ситами 4А в плотно закрытых флаконах N-Метилимидазол: перегоняют на колонке с длинным дефлегматором и хранят над молекулярными ситами Диизопропилэтиламин: перегоняют на колонке с длинным дефлегматором и хранят над молекулярными ситами Диэтиловый эфир: безводный эфир (Fluka, хранят над
Na/Pb)
Тетрагидрофуран — вода — лютидин (2:2:2, по объему) Литература
Beucage S. L., Caruthers М. Н. (1981). Tetrahedron Lett., 22, 1859.
Chow F., Kempe Т., Palm G. (1981). Nucleic Acids Res., 9, 2807.
Daub G. W., van Tamelen E. E. (1977). J. Am. Chem. Soc., 99, 3526.
De Bernardini S., Waldmeier F., Tamm C. (1981). Helv. Chim. Acta, 64, 2142. Efimov V. A., Reverdatto S. V., Chakhamakhcheva О. B. (1982). Nucleic Acids Res., 10, 6675.
Frank R„ Heikens W., Heisterberg-Moutsis G„ Blocker H. (1983). Nucleic Acies Res., 11, 4365.
Gait M. J., Matthes H. W., Singh М., Sproat B. S., Titmas R. C. (1982). Nucleic Acies Res., 10, 6243.
Hsiung H.. Inouge S., West J., Sturm B., Inouge M. (1983). Nucleic Acids Res., 11, 3227.
Ike G., Ihuta S., Sato М., Huang Т., Itakura U. K. (1983). Nucleic Acids Res.,
11,477.
McBride L. J., Caruthers М. H. (1983). Tetrahedron Lett., 24, 245.
Reese С. B., Titmas R. C., Yau L. (1978). Tetrahedron Lett., 19, 2727.
Sproat B. S., Bannwarth W. (1983). Tetrahedron Lett., 24, 5771.
Ti G. S., Gaffney B. L., Jones R. A. (1982). J. Am. Chem. Soc., 104, 1316.
Глава 6
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ) биологически активных белков в нанограммовых (пикомольных) количествах
К. Ройтч, М. Барнес
I. ВВЕДЕНИЕ
Разделение и получение биологически активных белков в пикомольных количествах стало в течение последних пяти лет рутинной процедурой благодаря успехам в области высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ)!). Фракционирование антигенов гистосовместимости с помощью ВЖХ уже было описано (Allvarez et al., 1981), а вопросам разделения иммуноглобулинов этим методом посвящена гл. 7 данной книги.
Одними из первых разделение стандартных белков с помощью ВЖХ провели Ренье и Ноэль (Regnier, Noel, 1976) на носителях для эксклюзивной хроматографии и Мёнч и Де-нен (Monch, Dehnen, 1978) на носителях для обратнофазовой ВЖХ (ВЖХ в обращенных фазах). Однако после того, как Рубинштейн и др. (Rubinstein et al., 1979) впервые выделили
