Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Для каждого этапа конденсации отбирают шприцем 1 мл этого стандартного раствора МСНТ, растворяют, перемешивая на вортексе, соответствующий блок для наращивания олиго-нуклеотидной цепи и тем же шприцем переносят смесь для конденсации в реакционный сосуд.
В. Активация амидитов для реакции на носителе
Для одного цикла элонгации в маленькие флаконы вносят 55 мг С-, А- или G-амидитов либо 50 мг Т-амидита. Флаконы закрывают пленкой, в которую вводят иглы от медицинского шприца, и высушивают в течение ночи в высоком вакууме в эксикаторе с хлористым кальцием. В этот же эксикатор помещают флакон на 10 мл, содержащий 333 мг возогнанного тетразола. На следующий день эксикатор заполняют аргоном и иглы вынимают. Тетразол растворяют в 10 мл безводного ацетонитрила. Для проведения одного этапа элонгации соответствующий амидит активируют 0,75 мл стандартного раствора тетразола, а затем смесь из флакона переносят шприцем в реакционный сосуд.
Г. Активация и связывание диэфиров
В состав реакционной смеси для присоединения мономера входит 13,3 мкмоль мономера [в виде триэтиламмониевой соли диэфира фосфорной кислоты МСНТ (20 мг, 67,5 ммоль)] и
126 мкмоль !чг-метилимидазола (10 мкл) в 100 мкл пиридина. Эту смесь готовят непосредственно перед добавлением к носителю. При добавлении димера указанные выше количества реагентов увеличивают на 50%.
Д. Проведение реакций
в условиях полного отсутствия влаги
Все реакции, для которых необходимо отсутствие влаги, проводят в специальной колбе, показанной на рис. 5-9. Ее используют для приготовления следующих компонентов: защищенных по азоту нуклеозидов (временная защита), диметокситри-тильных производных, З'-сукцинилированных нуклеозидов, З'-триэфиров фосфорной кислоты и амидитов. Исходный материал для приготовления многих из перечисленных компонентов необходимо высушивать многократным упариванием с пиридином. С этой целью исходный материал растворяют в соответ-
7*
100 Глава 5
Аргон, растворители. Пленка
Рис. 5-9.
ствующем объеме пиридина, после чего в колбу помещают магнитик для перемешивания на магнитной мешалке и отверстие бокового ввода колбы закрывают пленкой. Пиридин упаривают на роторном испарителе, кран закрывают и колбу, оставшуюся под вакуумом, отсоединяют. Затем ее заполняют аргоном через резиновую трубку от баллона. Эту процедуру повторяют два или три раза. По завершении последнего выпаривания баллон с аргоном от колбы не отсоединяют, благодаря чему внутри нее поддерживается небольшое избыточное давление аргона. Реакции проводят, помещая колбу на магнитную мешалку и добавляя в нее шприцем через пленку соответствующие реагенты и растворители.
Е. Тритильный анализ
Взвешивают 2—4 мг сухого носителя и помещают его в стандартную колбу на 10 мл. Колбу наполняют до отметки смесью хлорной кислоты (70%-ной) и этанола (3:2), встряхивают в течение примерно 10 мин и измеряют поглощение раствора при 495 нм. Полученное значение умножают на 10, чтобы определить величину полного поглощения; 71,7 оптической единицы соответствуют 1 мкмоль. Таким способом оценивают полный выход по завершении синтеза на носителе.
После промывок тетрагидрофураном (ТГФ) и эфиром носитель с полностью защищенной олигонуклеотидной цепью высушивают и прецизионно взвешивают. Этот материал (2—4 мг) обрабатывают, как описано выше, и определяют величину полного оптического поглощения.
Ж. Удаление защитных групп и очистка дезоксирибонуклеотидов
после синтеза на полимерном носителе
1. Удаление защитных групп
а. Триэфирный метод. После завершения синтеза носитель промывают ТГФ и эфиром и высушивают. Высушенный носитель взвешивают и отбирают несколько миллиграммов для определения полного выхода синтезированного продукта.
Методические подходы к синтезу олигонуклеотидов
101
К носителю добавляют 2 мл раствора, содержащего 140 мг st/n-о-нитробензальдоксима и 100 мкл тетраметилгуанидина в смеси диоксан — вода (1:1). Реакционную колбу закрывают пленкой, встряхивают непродолжительное время и оставляют на ночь при комнатной температуре.
На следующий день смесь фильтруют, носитель промывают еше 5 мл смеси пиридин — вода (1:1) и все фильтраты упаривают в колбе на 25 мл. Осадок разводят в 5 мл раствора аммиака (>25%) и колбу закрывают пленкой.
Колбу инкубируют в течение ночи при 50 °С, затем ее охлаждают, осторожно снимают пленку и полностью упаривают раствор.
Образовавшийся осадок разводят в 5 мл уксусной кислоты (80%-ной), выдерживают 1 ч при комнатной температуре, а затем упаривают. Осадок растворяют в нескольких миллилитрах воды и три раза экстрагируют эфиром. Водную фазу, содержащую суммарный незащищенный нуклеотидный препарат, упаривают.
б. Фосфитный метод. Носитель высушивают, как описано выше, и обрабатывают смесью тиофенол — диоксан — триэтил-амин (1:2:2 по объему) в течение 2 ч. Затем эту смесь удаляют отсасыванием в спиртовой раствор йода или в жавелевую воду. Носитель промывают диоксаном, метанолом, ТГФ, эфиром и высушивают. В сосуд добавляют 5 мл раствора аммиака (>25%), плотно запечатывают его пленкой и выдерживают при комнатной температуре или при 50 СС в течение ночи. После охлаждения пленку осторожно удаляют и смесь фильтруют в колбу на 25 мл. Носитель несколько раз промывают раствором аммиака и все смывы упаривают. Осадок разводят в 5 мл уксусной кислоты и обрабатывают так, как описано выше.
