Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Б. Триэфирный метод
На рис. 5-2 представлена последовательность химических реакций в триэфирном методе с использованием в качестве носителя пористого стекла.
Осн
ДМТ О-L/ ° \J
я ?
-р=о
I
О0
1) MCHT/N-метилимидазол
2) АсгО'ДМАП
Осн
но-ъ/°\д
Y_/
O'C-CHo-CHp-C'NH W-V н КП
II ? *11
о о
ДМТ Осн °1р _Р о
<§^°-н о,
О - С-СНо-СНр- C-NH v/vV II 41 ? II
о о
НКП
Н* (С12СНСОСН)
Осн ^
нот^
р i /ОУ-о-р=о
п 0с
О-С-СН^-СНо-С -NHWW- НКП
I! *- ^ II
о о
Нооый цикл
Рис. 5 2.
Методические подходы к синтезу олигонуклеотидов
91
Осн
ДМТ °~^°^|
0
1
„Рч 's Н3СО N О
1) UN |
4=N
2) -АС20/ДМАП
3) Иод
Осн
W
0-C-CH9-CH?-C-NHw^HKn
II н
о О
Осн
ДМТ О-I/ ° vj
H,C0-P=0
Л
х>
О—С—СНт—СНр—С-NHVW» НКП н * Н
О о
У
(С12СНС00Н)
Рис. 5-3.
Хороший выход при конденсации З'-фосфоэфира и 5'-0Н-группы наблюдается в присутствии мезитиленсульфонилнитро-триазола (МСНТ), причем реакцию можно ускорить добавлением в качестве катализатора N-метилимидазола (Sproat, Bannwarth, 1983). В результате время присоединения составляет 15 мин для мономеров и 20 мин для димеров.
Непрореагировавшие 5'-ОН группы следует блокировать смесью уксусный ангидрид (Ас20)/диметиламинопиридин (ДМАП). Эту процедуру можно опустить, если выход продуктов на каждом этапе наращивания достаточно высок и синтезируемый олигонуклеотид не имеет слишком большую длину. После удаления защитной диметокситритильной (ДМТ) группы можно начинать новый цикл синтеза.
Вместо мономеров используют также димеры или блоки еще большей длины, что приводит к уменьшению числа этапов конденсации, необходимых для получения цепей определенной длины.
В. Фосфитный метод
Последовательность химических реакций при использовании фосфитного метода (Beaucage, Caruthers, 1981; McBride, Са-ruthers, 1983) представлена на рис. 5-3.
Связывание между мономером (амидитом) и 5'-гидроксиль-ной группой предыдущего нуклеотида осуществляется с помощью активации тетразолом. В качестве мономеров предпо-
92 Глава 5
Оси ^ О Осн
+ <^o-f-c, -----> WJ0lf^°y
1--- o-ch2-ch2-cn Cl J
OH
Рис. 5-4.
#- °T 1
о
o-ch2-ch2-cn
трег-Б утиламин, пиридин
Осн
ДМТ 0-1/°'''J __/С1
&°-ь°
читают использовать морфолино- и диизопропиламиноамидиты (McBride, Caruthers, 1983), которые дают высокие выходы при связывании и весьма стабильны, что позволяет хранить их в течение длительного времени. В случае необходимости блокируют свободные гидроксильные группы. Дополнительным шагом при использовании этого метода является окисление фосфита до триэфира фосфорной кислоты. Продолжительность всего цикла относительно невелика (15 мин), но наращивать цепь можно добавлением только мономеров.
Г. Защищенные блоки элонгации
1. З'-Диэфиры фосфорной кислоты
Поскольку • очистка диэфиров фосфорной кислоты — процедура довольно сложная, предпочтительнее синтезировать три-эфиры (De Bernadini et al., 1981), которые легко поддаются очистке с помощью хроматографии на коротких колонках. Перед использованием в синтезе защитную цианэтильную группу отщепляют, добавляя смесь грег-бутиламин — пиридин, как это показано на рис. 5-4. Эта процедура дает З'-диэфиры фосфорной кислоты хорошего качества (Hsiung et al., 1983). При работе с «незащищенными» нуклеозидами экзоциклические аминогруппы гуанина, цитозина и аденина необходимо блокировать. Для этой цели очень эффективна методика так называемой «временной защиты» Джонса (Ti et al., 1982).
Методические подходы к синтезу олигонуклеотидов
93
Следующим шагом является введение в б'-положение диме-токситритильной группы. Полученные производные используют в качестве исходного материала для приготовления З'-триэфира фосфорной кислоты или соответствующих амидитов.
