Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
и. Водную фазу концентрируют с помощью бутанола (3—
4 раза) до объема ~400 мкл.
к. Этот раствор переносят в эппендорфовскую пробирку на
1,5 мл, заполняют ее доверху этанолом и инкубируют при —70 °С 10 мин.
л. Смесь центрифугируют в микрофуге и супернатант удаляют.
Если осадок содержит большое количество солей, их отмывают 70%-ным этанолом при комнатной температуре до тех пор, пока ДНК не обессолится (3—4 раза). ДНК высушивают и растворяют в нужном объеме Н20.
Примечание: Фрагменты ДНК, полученные с помощью этого метода, не содержат ингибирующих примесей, и их можно использовать во всех ферментативных реакциях (например, в реакциях лигирования, ник-трансляции и т. д.).
6—1278
82 Глава 4
I
Г. Лигирование выделенных фрагментов
с соответствующим вектором
Соотношение вектор/фрагмент должно составлять одну молекулу вектора на 5—10 молекул фрагмента.
10Х Буфер для ДНК-лигазы фага Т4 5 мкл
ДНК (вектор и фрагмент) +Н20 до 44 мкл+1 мкл
сверхчистой ДНК-лигазы фага Т4
Инкубируют при комнатной температуре 1 ч.
Примечание. При лигировании тупых концов добавление второго микролитра ДНК-лигазы фага Т4 после 30-минутной инкубации увеличивает число лигированных молекул.
Д. Получение компетентных бактерий
с помощью СаСЬ
1. Засевают 100 мл LB-среды 1,0 мл ночной культуры бактерий и выращивают на качалке при 37 °С до тех пор, пока А550 не станет равной 0,5.
2. Охлаждают до 0°С, центрифугируют на центрифуге Sorval 10 мин при 5000 об/мин. Внимание: во время процедуры бактерии оставляют в пробирках во льду.
3. Осадок бактерий ресуспендируют в 50 мл 10 мМ NaCl и центрифугируют 10 мин при 5000 об/мин.
4. Осадок бактерий вновь аккуратно суспендируют в 20 мл 30 мМ СаСЬ и инкубируют во льду 20 мин.
5. Еще раз центрифугируют в аналогичных условиях и ресуспендируют осадок в 2,0 мл 30 мМ СаСЬ-
Примечание. Компетентные бактерии можно хранить в холодильнике несколько дней.
Е. Трансформация компетентных бактерий
К 300 мкл компетентных бактерий добавляют лигированную ДНК (максимум 25 мкл), инкубируют во льду 60—90 мин, а затем при 42 °С 2 мин (тепловой шок) добавляют 1,0 мл LB-среды (при комнатной температуре) и инкубируют 30 мин при 37 °С.
Засевают трансформированные бактерии (два или три разведения) в чашки с L-агаром, содержащим соответствующий селектирующий агент, и выращивают в течение ночи при 37 °С.
Одиночные колонии используют для засева культур объемом
3 мл при выделении мини-плазмидных ДНК (разд. IV, А) или для засева культур объемом 100 мл.
Конструирование векторов
83
Ж. Стратегия для отбора генетических конструкций
1. Высокоэффективные методы генетической инженерии, такие как вставка фрагментов ДНК с двумя различными сайтами рестрикции, легко реализовать на практике с материалом, получаемым из одиночной колонии с применением метода экстракции мини-плазмид (разд. IV, А) или метода картирования с помощью рестриктаз.
2. Селекцию векторов, полученных путем делеции или изменения одного сайта рестрикции (путем удаления последовательностей ДНК, содержащих один сайт рестрикции, лигирования липких концов, образующихся под действием различных рестриктаз, гидролиза одного сайта рестрикции нуклеазой Ва/31 или гидролиза липких концов нуклеазой S1 и последующего лигирования по тупым концам), выполняют следующим образом:
а. Трансформированные клетки выращивают в 3 мл среды LB в течение ночи с использованием соответствующего селектирующего агента и получают плазмидную ДНК мини-методом (разд. IV, А).
б. Проводят гидролиз ферментом рестрикции, специфическим по отношению к сайту, который должен быть удален, для того чтобы линеаризовать векторы, прошедшие через ферментативные реакции, перечисленные на стадии 2 (см. выше).
в. Компетентные бактерии трансформируют с помощью 1 мкл гидролизованной плазмидной ДНК (в отсутствие лигирования!) (разд. IV, Е) и высевают в соответствующие чашки с L-агаром.
Анализ одиночных колоний с помощью рестрикционного гидролиза ДНК, полученной мини-методом (разд. IV, А), должен указывать на высокую частоту присутствия нужной конструкции (до 90% в зависимости от качества ферментных обработок) .
3. Селекция конструкций, в которых один сайт рестрикции создан путем вставки фрагмента ДНК или сайт-специфическо-го мутагенеза.
а. Руководствуются описанием стадий 2, а и 2, б, приведенных выше. Плазмиду получают непосредственно из трансформированной клеточной культуры и гидролизуют ее с помощью соответствующего фермента.
б. Проводят электрофорез в геле легкоплавкой агарозы (разд. IV, В) и вырезают нужную полосу; подвижности линеаризованной плазмиды и сверхспиральной формы той же молекулярной массы различаются. Используют небольшую часть геля, так чтобы линеаризованная плазмида, которая может составлять лишь небольшую долю
6*
84 Глава 4
LVDJ См5 Cum
