Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Б. Обычно используемые векторы
pSV2gpt:
(Oi et al., 1983):
pSV2neo:
(Southern, Berg, 1982): pAG60:
(Garefin-Colbere et al., 1981):
селекция у прокариот; селекция у эукариот:
селекция у прокариот: селекция у эукариот: селекция у прокариот:
селекция у эукариот:
ампициллин (50 мкг/мл) микофеноловая кислота или среда ГАТ ампициллин (50 мкг/мл) G-418
ампициллин (50 мкг/мл) тетрациклин (12,5 мкг/мл) G-418
Селекция резистентности в эукариотических клетках опи сана в гл. 2.
III. МАТЕРИАЛЫ И ИСХОДНЫЕ РАСТВОРЫ
1. СТЭТ-буфер (Сахароза, Тритон, ЭДТА, Трис)
8% сахарозы (25%-ный исходный раствор в воде) 5% тритона Х-100
50 мМ Ыа2-ЭДТА (исходный 0,25 М раствор)
76 Глава 4
50 мМ трис-H.Cl, pH 8,0 (2,0 М исходный раствор хранят при комнатной температуре)
2. Лизоцим (Sigma L-6876)
10 мг/мл в Н20 (хранят при —20 °С)
3. Насыщенный фен,олом трис-буфер, 0,1 М, pH 7,5, 50 объемов (исходный)
СНС1з 48 объемов Изоамиловый спирт 2 объема
4. ТЭН-буфер (Трис, ЭДТА, NaCl)
50 мМ трис, pH 8,0 5 мМ №2-ЭДТА 50 мМ NaCl
5. 1,0МСаС12
6. Ацетат натрия 3,0 М, pH 7,5
7. Сефароза CL-4B (Pharmacia 17-0150-01) в 10 мМ трисе, pH 8,0, 0,1 мМ ЭДТА
8. ТА-буфер (Трис, Ацетат)
40 мМ трис-ОН, pH 8,1
20 мМ уксусная кислота, pH 8,1
2 мМ №2-ЭДТА, pH 8,1
9. Агароза, тип II (Sigma) А-6877
10. Низкоплавкая агароза (Sigma) А-418 И. 5 М NaCl
12. Насыщенный фенолом 500 мМ NaCl
13. 10Х Буфер для ДНК-лигазы фага Т4 (хранят при —20 °С)
500 мМ трис-НС1, pH 7,8
100 мМ дитиотрейтол (Sigma) D-0632
10 мМ АТР
500 мкг/мл БСА (Sigma) А-4503
14. ДНК-лигаза фага Т4 (Anglian Biotechnology, Ltd.)
15. 10 мМ NaCl (автоклавированный)
16. 30 мМ СаС12 (автоклавированный)
17. Среда LB (Лурии — Бертами). Среда содержит в 1 л:
Бактотриптон 10 г Бактоист-экстракт 5 г NaCl 10 г
(pH доведен до 7,5 с помощью гидроксида натрия)
IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ
А. Экстракция мини-плазмид
Ниже описан простой и быстрый метод получения плазмид из небольших количеств жидких культур для последующего анализа с помощью рестриктаз (Holmes, Quigley, 1981).
1. 3,0 мл среды LB с соответствующим селектирующим
Конструирование векторов
77
агентом засевают одиночной колонией бактерий, которые содержат определенный вектор, и инкубируют в течение ночи при 37 °С на качалке.
2. 1,5 мл переносят в эппендорфовскую пробирку объемом
1,5 мл (или сходную с ней) и осаждают бактерии путем центрифугирования (в «микрофуге»).
3. Супернатант удаляют и осадок ресуспендируют в 350 мкл СТЭТ-буфера.
4. Добавляют 25 мкл раствора лизоцима и быстро вносят на 40 с в кипящую водяную баню.
5. Центрифугируют на микрофуге и переносят супернатант в новую эппендорфовскую пробирку.
6. Добавляют равный объем изопропанола и осаждают материал в течение 20 мин при —20 °С.
7. Центрифугируют на микрофуге, удаляют супернатант и осадок высушивают в эксикаторе.
8. Осадок ресуспендируют в 50 мкл НгО.
Для того чтобы полосы ДНК были видны в геле после гидролиза рестриктазой, достаточно 5 мкл этого экстракта.
Примечание. Одновременно можно проводить экстракцию 12 или большего числа плазмид, что делает этот способ весьма удобным для быстрого анализа векторов, получаемых с помощью методов генетической инженерии.
Б. Быстрое препаративное получение плазмид
С помощью этой процедуры, разработанной на основе метода, описанного в разд. IV, А, можно получать препараты плазмид очень высокой чистоты. Из одной культуры объемом 100 мл получают до 1 мг плазмидной ДНК.
1. 100 мл среды LB с препаратом, используемым для селекции на резистентность, засевают одиночной колонией бактерий и ицкубируют в течение ночи на качалке при 37 °С.
2. Культуру переносят в полипропиленовые флаконы на 250 мл (с диаметром 70 мм) и центрифугируют на центрифуге Sorval (ротор А6.14) 10 мин при 5000 об/мин.
3. Супернатант удаляют, а осадок бактерий ресуспендируют в 20 мл СТЭТ-буфера.
4. Добавляют 1 мл раствора лизоцима и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 с, прогревают в микроволновой печи (1000 Вт) до кипения, пока пена не достигнет края пробирки (20—30 с).
5. Центрифугируют на центрифуге Sorval (ротор А6.14), 10 мин при 10 000 об/мин.
6. Переносят супернатант в полипропиленовую пробирку на 50 мл (диаметр 25 мм) и добавляют равный объем смеси фе-
78 Глава 4
нол/хлороформ/изоамиловый спирт. Интенсивно перемешивают и центрифугируют на центрифуге Sorval (ротор S34) при 15000 об/мин.
7. Повторяют процедуру, описанную на предыдущем этапе, до тех пор, пока не исчезнет нерастворимый материал на границе раздела фаз (обычно требуется два повтора).
8. Водную фазу экстрагируют хлороформом.
9. Супернатант переносят в чистую пробирку на 50 мл и добавляют равный объем изопропилового спирта. Инкубируют в течение 20 мин при —20 °С, давая возможность ДНК выпасть в осадок.
