Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
В. Эукариотическая система
Для экспрессии кДНК в эукариотических клетках необходимо вставить в вектор эукариотический промотор, эукариоти-
Клонирование кДНК
73
ческий сайт связывания с рибосомой, сигнал для сплайсинга РНК (если это необходимо), сигнал терминации транскрипции и (или) сигнал для присоединения poly (А)-концевой последовательности. Было опубликовано много успешных работ по экспрессии клонированной геномной ДНК в эукариотических клетках, поскольку клоны геномной ДНК обладают всем необходимым для экспрессии. В то же время экспрессия кДНК в эукариотических клетках — задача не из легких. Общий подход ее решения был разработан Окаямой и Бергом (Okayama, Berg, 1983). Однако предложенные ими плазмидные векторы не содержат маркеров для селекции, которые необходимы для того, чтобы на ранних стадиях идентифицировать трансформированные клетки. Недавно Окаяма и Берг разработали новый метод трансформации эукариотических клеток с помощью вектора, представляющего собой комплекс кДНК/плазмида/фаг % с геном NEO, с помощью которого можно получить высокую эффективность трансформации, до 1—3% (П. Берг, личное сообщение). Другой подход заключается в использовании векторов на основе ретровирусов, которые дают высокую эффективность трансформации и интеграции ДНК в хромосомы. В этом случае необходимо решить проблему, как можно после идентификации клона повторно вырезать интегрированную кДНК из ДНК клетки и амплифицировать ее.
Литература
Bantle J. A., Maxwell I. Н., Hahn W. Е. (1976). Anal. Biochem., 72, 413. Edman J. С., Hallewell R. A., Valenzuela P., Goodman H. М., Rutter W. J.
(1981). Nature (London), 291, 503—506.
Hallewell R. A., Emtage S. (1980). Gene, 9, 27—47.
Hanahan D. (1983). J. Mol. Biol., 166, 557—580.
Harris T. J. R. (1983). In: Genetic Engineering (R. Williamson, ed.), pp. 128— 185, Academic Press, New York.
Heidecker C„ Messing J. (1983). Nucleic Acids Res., 11, 4891—4906.
Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J., eds. (1983). Molecular Cloning — A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
McDonnell M. W., Simon M. N., Studier F. W. (1977). J. Mol. Biol., 110, 129—146.
Morse D. E., Mosteller R. D., Yanofsky C. (1969). Cold Spring Harbor Svmp.
Quant. Biol., 34, 725—740.
Okayama H„ Berg P. (1982). Mol. Cell. Biol., 2, 161—170.
Okayama H„ Berg P. (1983). Mol. Cell. Biol., 3, 280—289 RRtter U„ Muller-Hill B. (1983). EMBO J., 2, 1781—1794.
Shepard H. M„ Yelverton E„ Coeddel D. V. (1982). DNA, 1, 125—131.
Taub F., Thompson E. B. (1982). Anal. Biochem., 126, 222—230.
Глава 4
Конструирование векторов для «обратной генетики» иммуноглобулинов
А. Траунекер
I. ВВЕДЕНИЕ
Успехи, достигнутые на протяжении последних лет в области генетической инженерии и методов переноса генов, дали возможность непосредственно решать многочисленные вопросы, касающиеся экспрессии генов и регуляции их активности. Гены высокоспециализированных клеток, таких как клетки В-лимфо-цитарного направления дифференцировки, были перенесены в нелимфоидные клеточные линии для изучения тканеспецифических контрольных элементов на уровне ДНК (Banerji et al., 1983; Gillies et al., 1983).
Путем микроинъекции генов, кодирующих немодифициро-ванные легкие цепи иммуноглобулинов (Briuster et al., 1983), или путем введения искусственных конструкций, содержащих полные функциональные гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов (Rusconi, Kohler, 1985), были получены трансгенные мыши. Исследования на таких мышах дали ценную информацию в отношении перестройки иммуноглобулиновых генов, механизмов активации и эффектов обратной связи во время дифференцировки В-клеток в присутствии функционально перестроенного полного гена иммуноглобулина. Гены, модифицированные in vitro и вносимые в определенные клеточные линии, дают возможность нового подхода к изучению определенного клеточного продукта на разных стадиях, начиная от перестройки или активации транскрипции и кончая последними этапами, а также многочисленными стадиями процессинга между ними.
На протяжении последних нескольких лет методы генетической инженерии значительно упростились и в настоящее время широкодоступны. В данной главе мы остановимся на нескольких основных процедурах. После ознакомления с ними будет нетрудно использовать описанные здесь методы для изучения новых систем.
Конструирование векторов
75
Hindi
Рнс. 4-1. Плазмидные векторы для селекции в эукариотических клетках. А. Вектор pSV2gpt, селектируемый в среде ГАТ или на микофеноловой кислоте; контроль за счет энхансера-промотора вируса SV40. Б. Вектор pSV2neo, селектируемый препаратом G-418; контроль за счет энхансера-промотора вируса SV40. Б. Вектор pAG60, селектируемый препаратом G-418; контроль за счет промотора гена тимидинкиназы вируса простого герпеса.
II. ОБЩАЯ СТРАТЕГИЯ
А. Векторы для клеточной трансформации
Векторы, используемые для клеточной трансформации, представляют собой плазмиды, которые помимо участка начала репликации содержат один ген резистентности, применяющийся для селекции в клетках прокариот, и второй ген резистентности, который может использоваться для селекции в эукариотических клетках. Такие векторы имеют также несколько сайтов рестрикции, по которым и проводят клонирование нужного гена. Ряд векторов, обладающих этими свойствами, показан на рис. 4-1.
