Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Клонирование кДНК
65
Пробу нагревают до комнатной температуры и осаждают ДНК центрифугированием (центрифуга Eppendorf) в течение 10 мин. Осадок растворяют в 20—50 мкл 2 М ацетата аммония и повторяют осаждение этанолом 3 раза. dNTP должны уйти из препарата ДНК практически полностью. Это очень важно для следующего этапа — формирования oligo(dC)-концевых последовательностей. Наконец, ДН'К растворяют в 1X ТЭ-буфе-ре до концентрации 0,1 пмоль концов в 1 мкл.
3. Присоединение oligo(d ^-последовательностей к кДНК в реакции с ТдН-трансферазой
а. Предварительный опыт
Для определения времени инкубации, необходимого для присоединения к тупым концам молекул ДНК oligo(dN)-концевых последовательностей нужной длины, ставят предварительный эксперимент с известным количеством ДНК с тупыми концами, концентрация которой равна концентрации кДНК. Для этой цели можно использовать гидролизат плазмиды pBR322, получаемый под действием рестриктазы Ятс11. Расчет проб аналогичен представленному в разд. III, В, 2, а.
Гидролизат pBR322 — Hindi 0,1 (пмоль концов)/мкл,
10 мкл
5XБуфер для ТдН-трансферазы 7,2 мкл
0,3 мМ dCTP 7,9 мкл
32P-dCTP 10 мкКи/мкл, 3000 Ки/ммоль, 1,2 мкл
Н20 7,2 мкл
ТдН-трансфераза 15 ед./мкл, 2,5 мкл
На диски бумаги DE82 через 0, 2, 4, 6 и 10 мин инкубации отбирают по две аликвоты объемом 2 мкл. Все другие условия те же, что и на этапе «в» разд. III, В, 2.
б. Реакция с комплексом кДНК — вектор-затравка
Готовят реакционную смесь, содержащую кДНК — вектор-затравку в количестве, предварительно определенном в модельной реакционной смеси с гидролизатом pBR322 — Hindi. Рекомендуется также провести предварительную реакцию для оценки длины oligo(dN)-концевых последовательностей, присоединяемых к известному количеству ДНК в аналогичных условиях.
Примеры реакций приведены в табл. 3-1.
Реакционные смеси инкубируют при 37°С (реакция начинается после добавления фермента) в течение времени, определенного по данным предварительного эксперимента (разд III,
5—1278
66 Глава 3
Таблица 3-1
Компоненты смеси Реакция А Реакция Б
к ДНК --- в-з pBR322 --- Hincll
(~0,1 нмоль кон- (0,1 пмоль кон-
цов/мкл), мкл цов/мкл), мкл
ДНК 15 10
5 X Буфер для ТдН-трансферазы 10,8 7,2
0,3 мМ dCTP 11,85 7,9
32P-dCTP 1,8 1,2
10 мМ C0CI2 5,4 3,6
Н20 7,4 4,9
ТдН-трансфераза 15 ед./мкл 1,8 1,2
Всего: 54 36
Д, 3, а). По завершении инкубации пробирки переносят в лед и оставляют при 0°С во время выполнения процедур, аналогичных тем, которые описаны для стадии III, В, 2, в.
Примечание. В начальный момент инкубации отбирают две аликвоты по 2 мкл и наносят их на диски фильтров DE82. Процедуры аналогичны тем, которые описаны в разд. III, В, 2, в. После получения нужной длины oligo(dN)-концевой последовательности (15 dC-нуклеотидов/конец) комплекс кДНК — вектор затравка в реакционной смеси для ТдН-трансферазы гидролизуют рестриктазой //mdlll аналогично тому, как описано на стадии III, В, 2, г (см. следующий этап — разд. III, Д, 3, в).
в. Гидролиз рестриктазой Hin6l\l комплекса
кДНК — oligo(dC)-концевая последовательность с мРНК — вектором-затравкой
Реакционную смесь после реакции в присутствии ТдН-трансферазы разбавляют следующим образом:
ДНК в реакционной смеси для ТдН-трансферазы ~50 мкл
10х Буфер для рестрикции Hin6.Hl 50 мкл Н20 400 мкл
Смесь прогревают при 65 °С 20 мин, для того чтобы остановить реакцию наращивания oligo(dN)-концевых последовательностей, и отбирают пробу 10 мкл, которая служит негидролизованным стандартом ДНК. В смесь добавляют ~ 10 ед. рест-рпктазы #mdIII, инкубируют ее при 37°С 30 мин и отбирают еще одну пробу объемом 10 мкл для проверки полноты гидролиза электрофорезом в 2%-ном агарозном геле.
Клонированне кДНК
67
После полного гидролиза комплекс кДНК/мРЦК— вектор-затравка отделяют от других продуктов рестрикции Hindlll с помощью хроматографии на S-500.
г. Очистка комплекса кДНК — вектор-затравка,
несущего Hindlll-конец
К реакционной смеси добавляют */ю объема 50X стоп-буфера (10Х ТЭ-буфер + 2% ДСН) и наносят материал на колонку с сефакрилом S-500 (0,7X40 см), уравновешенную 1ХТЭ-бу-фером + 2% ДСН. Собирают фракции объемом по 20 капель и определяют радиоактивность в каждой фракции по Черенко-ву. Во фракциях вышедшего со свободным объемом пика определяют содержание ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле и радиоавтографии. Для электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле отбирают 5—10 мкл ДНК каждой третьей фракции.
Фракции, не содержащие малый радиоактивный фрагмент ДНК (по данным радиоавтографии), объединяют и ДНК осаждают этанолом после двукратной фенольной экстракции и однократной экстракции эфиром в присутствии 10 мкг тРНК-носителя.
