Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
б. Добавляют ДСЛ (до концентрации 0,2%), 5 М NaCl до концентрации 0,5 М и 10Х ТЭ-буфер до концентрации 1X ТЭ, так чтобы окончательный объем был равен 40— 50 мл.
в. Образец наносят на заранее уравновешенную колонку с
Клонирование кДНК
57
oligo(dT)-целлюлозой. Рекомендуется пользоваться перистальтическим насосом и УФ-монитором с двумя проточными кюветами (например, ISCO UA-5) для измерения оптической плотности элюата. Детали хроматографии описаны отдельно.
г. Элюированную фракцию poly (А)-РНК осаждают этанолом (1/30 объема 3,0 М ацетата натрия и 2,5 объема этанола) при —20 °С в течение ночи.
д. Центрифугируют при 15000—20 000 об/мин в течение 5 мин в роторе SW-27 при 4°С. Центрифужные пробирки должны быть хорошо промыты и перед использованием обработаны ДЭПК. Рекомендуется предварительно заполнить их 70%-ным этанолом и отцентрифугировать при 20 000 об/мин в течение 15 мин, для того чтобы собрать в виде осадка мелкие частички пыли, которые не были отмыты.
е. Супернатант сливают и осадки РНК высушивают.
ж. Осадки растворяют в 1X ТЭ-буфере (общий объем 0,4 мл).
з. Добавляют 4 мл ДМСО.
и. Добавляют 0,4 мл буфера с 1 М LiCl. к. Смесь прогревают при 50 °С 5 мин.
л. К пробе добавляют 0,5 М NaCl в IX ТЭ-буфере (без ДСЛ) до конечного объема 50 мл. м. Теперь материал готов для вторичного нанесения на колонку с oligo(dT)-целлюлозой. Для удаления загрязняющей рРНК лучше всего воспользоваться ДМСО (Bantle et al., 1976).
н. Элюированную фракцию poly (А)-РНК осаждают этанолом, как описано для этапа «г». о. Пробу центрифугируют при 15 000—20 000 об/мин 20 мин при 4°С в роторе SW-27, как на этапе «д». п. Осадок растворяют в 100—300 мкл Н20 и переносят в большую эппендорфовскую пробирку, р. Добавляют 1/30 объема 3 М ацетата натрия, 2,5 объема этанола и оставляют на ночь при —20 °С. с. Смесь центрифугируют в центрифуге Eppendorf и супернатант сливают, т. После высушивания осадок растворяют в 40 мкл НгО. Отбирают аликвоты, разбавляют их в 200 раз и определяют Агбо и Агво. Рассчитывают концентрацию мРНК (концентрация, равная 1 мг/мл, дает А26о=24) и оценивают чистоту мРНК (для чистой РНК отношение А2бо/А28о>2,0). Доводят концентрацию РНК до
0,5 мкг/мл водой, у. Проверяют активность мРНК в препарате с использова-
58 Глава 3
нием системы лизата ретикулоцитов кролика, ф. Проверяют распределение РНК по размерам с помощью электрофореза в агарозном геле (Maniatis et al., 1983). х. Препарат мРНК хранят при —70 °С.
В. Подготовка вектора-затравки
Окаяма и Берг (Okayama, Berg, 1983) используют в качестве вектора-затравки в описанном ими уникальном методе синтеза кДНК сконструированную плазмиду pcDVl (рис. 3-3). При конструировании библиотеки кДНК для экспрессии в бактериях необходимость в этой плазмиде возникает далеко не всегда, однако когда она используется, то более легкой задачей является перевод экспрессируемого клона из Е. coli в эукариотическую систему. Это достигается за счет замены участка, соответствующего промотору.
Схематически метод Окаямы — Берга проиллюстрирован на рис. 3.2.
1. Материалы.
а. pcDVl 100 мкг
б. Рестриктаза Kpnl и буфер для рестрикции Kpnl
в. Рестриктаза ?coRI и буфер для рестрикции EcoRl
г. Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (ТдН-трансфераза)
д. Буфер для ТдН-трансферазы 5Х:
Какодилат натрия]) 700 мМ Трис-НС1 pH 6,8, 150 мМ Дитиотрейтол (ДТТ) 10 мМ Буфер хранят в малых аликвотах в замороженном состоянии при —20 °С.
е. 10 мМ СоСЬ
ж. 10 мМ dTTP
з. Перегнанный фенол и севаг
и. тРНК, проэкстрагированная фенолом (10 мг/мл в Н20) к. Диски из ДЭАЭ-целлюлозы (ДЕ82), диаметр 25 мм
л. 0,5 М Na2HP04
м. Раствор БСА (фракция V) 10 мг/мл, профильтрованный н. 1,5%-ные агарозные гели для аналитического и препаративного электрофореза о. Колонка с oligo(dA)-целлюлозой (0,7x5 см), уравновешенная 1 М NaCl в 1хТЭ-буфере при 4°С п. 1 М NaCl в 1X ТЭ-буфере при 4 °С
1} Какодилат натрия перед использованием должен подвергаться очистке (Maniatis et al., 1983, p. 239).
Клонирование кДНК
59
р. Н20 комнатной температуры с. 3 М ацетат натрия т. Абсолютный этанол
у. Буфер ТБЭ, 10Х: 1,0 М трис-борат, pH 8, 0,02 М ЭДТА
2. Приготовление вектора-затравки
а. Гидролиз плазмиды pcDVl рестриктазой Kpnl
Реакционная смесь
Плазмида pcDVl 100 мкг
1X Буфер для рестриктазы Kpnl, конечный объем 500 мкл
Рестриктаза Kpnl 20 ед.
Смесь инкубируют 15 ч при 37 °С, затем отбирают пробу объемом 2 мкл и проверяют степень гидролиза с помощью аналитического электрофореза в агарозном геле. Если гидролиз прошел неполностью, то добавляют еще 20 ед. рестриктазы Kpnl и инкубируют при 37 °С в течение необходимого времени. После того как гидролиз прошел полностью, переходят к следующему этапу.
б. Депротеинизация
Экстрагируют пробу повторно смесью фенол — севаг до тех пор, пока с границы раздела фаз не исчезнет нерастворимый материал. Экстрагируют еще один раз эфиром или севагом, осаждают ДНК, добавляя 1/30 объема 3 М ацетата натрия и
