Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 215

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 209 210 211 212 213 214 < 215 > 216 217 218 219 220 221 .. 239 >> Следующая

Лапку животного держат левой рукой и вводят в вену кончик пипетки под возможно меньшим углом. Если пипетка не забьется тканью, то кровь потечет сразу; 0,3—0,5 мл крови поступает в пипетку без засасывания. Необходимый поток крови поддерживают мягким нажатием перпендикулярно и вдоль оси вены.
Кровь выдувают из пипетки в центрифужную пробирку, содержащую 1 мл ЗФР с гепарином (10 ед./мл). Обычно рана не кровоточит, и если она небольшая, то ее можно не зашивать. Раны у Xenopus заживают быстро, и через 2 нед можно снова брать кровь из той же лапки. Иногда повторное вскрытие раны затруднено из-за прилежащих соединительно-тканных тяжей, и в этом случае кровь следует брать из другой лапки. Лягушки способны переносить большие кровопотери; от животного массой 200 г можно получить 2—3 мл крови.
После забора крови лягушку в течение одного дня держат в воде, содержащей антисептик (2,5 мл лактата этакридина на 1 л).
От крупных животных можно легко и быстро получать кровь сердечной пункцией. Это очень быстрая процедура. Однако риск убить животное или не попасть в сердце и не взять кровь значительно больше, чем при заборе крови из вены задней лапки. Перед сердечной пункцией лягушку обездвиживают (наркозом или надевая на нее нейлоновый чулок) и кладут на спинку. В сердце под углом 45 °С к поверхности живота вводят иглу № 22. После этого иглу плавно вытягивают из животного, мягко оттягивая поршень шприца до тех пор, пока в него не начнет поступать кровь.
В. Забор крови и перитонеальной жидкости
у головастиков
У наркотизированных головастиков можно брать кровь из сердца. Головастики более чувствительны к действию наркотика, чем взрослые особи, поэтому для них следует использовать более высокие разведения MS222. Животных выдерживают
Рис. 25-4. Забор крови у Xenopus. А. Так надо держать животное. Б. Надрез. В. Положение вены. Г. Введение пипетки. Д. Забор крови.
480 Глава 25
2—3 мин в растворе, содержащем 0,1 г/л MS^22, после чего кладут на сцйнку на увлажненное бумажное полотенце под препаровальный микроскоп. Через разрез в коже и перикарде сррдце осторожно вынимают пинцетом, прокалывают его очень тонким кончиком пипетки (диаметр 0,15 мм), оттянутым, как описано в разд. III, Б, 1, и засасывают кровь в пипетку ртом через резиновую трубку (рис. 25-5). У личинки можно брать только небольшое количество крови; если взять слишком много, она может погибнуть. Даже у крупного головастика, достигшего стадии 55, нельзя брать >20 мкл крови.
Рис. 25-5. Забор крови у головастика. у личинок эритроциты бо-
лее нежные и быстрее агрегируют, чем у взрослых животных. Если проба крови предназначена для получения клеток, то предварительно в пипетку следует набрать 0,5 мл ЗФР с гепарином и 20% сыворотки Xenopus. После переноса клеток в пробирку их можно промывать и далее работать с ними так же, как с клетками взрослых животных.
Во многих тестах используют перитонеальную жидкость, которую получают следующим образом. Наркотизированное
Рис. 25-6. Забор перптонеальной жидкости у головастика.
животное кладут на бумажное полотенце под препаровальный микроскоп и в перитонеальную полость вводят стеклянную пипетку. Всасывать жидкость в пипетку через резиновую трубку ртом следует очень осторожно, так как в противном случае ее кончик будет забит обрывками брызжеечной ткани. Первые 10—20 мкл жидкости поступают в пипетку очень легко. Для забора большего объема перитореальной жидкости от одного
Изучение иммунной системы Xenopus____________________________481
животного следует вывести кончик пипетки к самой границе отверстия и прпытаться с помощью пинцета отделить стенку живота от кишечника, чтобы образовалась полость, из которой легче отбирать Жидкость (рис. 25-6). От одного головастика на стадии 55 при аккуратном манипулировании можно забрать 50 мкл перитонеальной жидкости.
Г. Тимэктомия
Тимэктомия — широко используемый прием в иммунологии. Удалить тимус у личинки Xenopus легче, чем у личинки любого другого рода амфибии, так как у нее эта железа расположена поверхностно и хорошо видна между глазами и барабанными полостями. Тимус может быть разрушен прижиганием с помощью высокочастотного микрокаутера. При этом окружающие тимус ткани нагреваются в меньшей степени, чем при обычном прижигании. Этот способ тимэктомии детально описан Хортоном и Мэннингом (Horton, Manning, 1972).
Д. Получение химерных зародышей
(Harrison, 1935; Davidson, 1966)
В стерильные, залитые агаром чашки Петри (дно чашек диаметром 35 мм зачерняют снаружи активированным углем; см. приложение), содержащие раствор Гольтфретера с антибиотиками (100 ед./мл пенициллина и стрептомицина) помещают зародыши на одной и той же стадии развития. При работе с диплоидными и триплоидными зародышами хорошо заметна разница в размерах их клеток: у последних клетки крупнее. Снимают пинцетом студенистую оболочку и скальпелем (№ 10 Aesculap work AG, ФРГ) разрезают зародыш поперек на уровне задней границы глотки. Передние отделы меняют местами и фрагменты зародышей сжимают друг с другом, помещая их в траншею, которую предварительно вырезают в агаре. Эта траншея должна быть короче, чем химерный зародыш, чтобы обеспечивалось встречное давление вдоль оси, способствующее срастанию фрагментов. На дорсальную поверхность химерного зародыша помещают кусочек покровного стекла, чтобы обеспечить заживление нервной трубки. Через 10—15 мин зародыши вынимают из траншеи, переносят на 2—3 дня в 10%-ный раствор Гольтфретера (с антибиотиками), а затем в воду.
Предыдущая << 1 .. 209 210 211 212 213 214 < 215 > 216 217 218 219 220 221 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed