Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
3. На слой 35%-ного перколла наносят 5—10 мл суспензии лимфоидных клеток (до 1,5-108 клеток).
4. Центрифугируют градиент при 1600 g 20 мин при комнатной температуре.
5. Обычно почти 100% клеток, выделенных из зоны между слоями 35%-ного и 75%-ного перколла, жизнеспособны (по окраске трипановым синим). 90—95% клеток на границе между средой и 35%-ным перколлом мертвые. Выход жизнеспособных клеток при использовании этого метода составляет 70—90%.
6. Перед использованием клетки два раза промывают.
4. Приготовление суспензий одиночных клеток из пейеровых бляшек
Препарат клеток пейеровых бляшек (получение см. ниже), приготовленный из подвздошной кишки, содержит менее 2% Т-клеток, а основная часть клеток имеет небольшие количества поверхностных IgM (Miyasaka et al., 1984 b).
1. Асептически отсекают сегмент терминальной части подвздошной кишки (длиной 10 см) и удаляют ее содержимое.
2. Тщательно промывают сегмент кишки в 200 мл стерильной среды МСИД или RPMI 1640.
3. Ткань помещают в чашку Петри, содержащую стерильную среду, отрезают скальпелем нелимфоидные ткани и разрезают исходный сегмент на три части размером 3X2 см.
4. Скальпелем соскабливают слизь с внутренней поверхности кишки и еще трижды промывают каждый кусочек культуральной средой, содержащей 200 ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина.
Овца как экспериментальная модель
459
5. Часть сегмента подвздошной кишки помещают в чашку Петри, содержащую 6 мл среды с антибиотиками и ДНКазой (Sigma D.0876, конечная концентрация 20 мкг/мл). Соскабливают лимфоидные фолликулы пейеровых бляшек с поверхности сегмента, разрезают их на мелкие части скальпелем, а затем несколько раз пипетируют, втягивая и выпуская МаТсрйал пипеткой на 10 мл до получения суспензии одиночных клеток. Использование на этом этапе ДНКазы сводит к минимуму агрегацию клеток.
6. Мертвые клетки удаляют центрифугированием суспензии в градиентах перколла (см. выше) и перед использованием клетки два раза промывают. Из сегментов подвздошной кишки длиной 10 см, выделенных из 1—3-месячных ягнят, обычно получают 5-Ю8— 1 -109 жизнеспособных клеток.
5. Выделение Т-клеток на колонке с нейлоновой ватой
Этот метод, исходно разработанный Юлиусом и др. (Julius et al., 1973), был модифицирован Кэхиллом и др. (Cahill et al., 1978) для лимфоцитов овец.
1. Нейлоновую вату из фильтров для разделения лейкоцитов LPI Leuko-Pak (Fenwal, США) кипятят в дистиллированной воде, высушивают в течение ночи во включенном ламинаре и вручную расправляют скрученные нити.
2. 0,6 г сухой нейлоновой ваты набивают в шприц одноразового пользования объемом 10 мл, к которому подсоединяют трубку с зажимом, в результате чего образуется колонка. Для шприцов объемом 35 мл используют 3,0 г нейлоновой ваты.
3. Нейлоновую вату в шприце постепенно смачивают, медленно добавляя забуференный физиологический раствор Дульбекко (Д-ЗФР), содержащий 10% сыворотки плода коровы (СГ1К) (Д-ЗФР-СПК). Шприц располагают вертикально и, осторожно постукивая пальцем по шприцу, удаляют пузырьки воздуха. Когда среда начнет вытекать из кончика шприца, зажим на его конце закрывают и продолжают добавлять среду до тех пор, пока нейлоновая вата полностью не смочится.
4. Открывают зажим и промывают колонку порцией Д-ЗФР-СПК (25 мл на шприц объемом 10 мл и 50 мл на шприц объемом 35 мл).
5. Шприц запечатывают и инкубируют при 37°С в течение 1 ч.
6. Готовят клетки и доводят их концентрацию до 5-107 клеток/мл в растворе Д-ЗФР-СПК.
7. Непосредственно перед нанесением клеток вату промывают еще раз 50 мл предварительно подогретого Д-ЗФР-СПК (100 мл на шприц объемом 35 мл).
460 Глава 24
8. Клеточную суспензию по каплям наносят на колонку [2 мл (108 клеток) на шприц объемом 10 мл и 10 мл (5-108 клеток) на шприц объемом 35 мл].
9. Добавляют в колонку 1 мл среды (3 мл для большой колонки) и, закрыв ее, инкубируют 45 мин при 37 °С.
10. GMblSSJOT Т-"Лртки, добавляя по каплям 25 мл предварительно подогретого Д-ЗФР-СПК (для большой колонки используют 50 мл раствора). Более 95% сходящих с колонки клеток дают положительную реакцию с моноклональными антителами ST-1, а 2—3% являются В-клетками, имеющими поверхностные иммуноглобулины. Антитела ST-1—это мышиные моноклональные антитела, взаимодействующие со всеми Т-клетками овец.
6. Отбор лимфоцитов, экспрессирующих поверхностные иммуноглобулины
Этот метод, исходно описанный Високи и Сато (Wysocki, Sato, 1978), был модифицирован Миязакой и др. (Miyasaka et al., 1983) для В-клеток овец.
1. В чашку Петри 100X20 мм (Falcon, номер по каталогу 1005) пипеткой наливают 6 мл раствора антител, содержащего кроличьи антитела против иммуноглобулинов овцы (10 мкг белка/мл) и кроличьи IgG (70 мкг белка/мл), и инкубируют чашку Петри при 4°С в течение ночи. (Антитела против иммуноглобулинов овцы можно использовать повторно.) Включение в смесь неспецифических кроличьих IgG уменьшает связывание имеющих поверхностные иммуноглобулины В-клеток с поверхностью чашки Петри, что способствует их легкому освобождению при промывке струей раствора из пипетки на этапе 7 описываемой процедуры.
