Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 206

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 200 201 202 203 204 205 < 206 > 207 208 209 210 211 212 .. 239 >> Следующая

15. Лимфу плода собирают в стерильный пластмассовый флакон, который подвязывают к держателю, укрепленному на боку животного.
456 Глава 24
б. Канюлирование яремной вены плода
1. С целью получения крови от плода проделывают процедуры, описанные в пп. 1—7.
2. Яремную вену плода канюлируют, используя трубки соответствующего диаметра [например, SV55 с внутренним диаметром 0,8 мм и наружным диаметром 1,2 мм (Dural Plastics)]. Канюлю наполняют солевым раствором с гепарином (50 ед./мл) и вводят до тех пор, пока ее конец не достигнет сердца. Следует проверить, достаточно ли свободно поступает кровь в шприц на внешнем конце трубки. Если поступление крови затруднено, то канюлю осторожно выводят из сердца до тех пор, пока кровь не пойдет достаточно свободно.
3. В катетер вводят гепаринизированный солевой раствор, так чтобы он заполнил просвет канюли. Это необходимо делать с осторожностью, чтобы гепаринизированный солевой раствор не попал в кровеносный сосуд. Канюлю фиксируют, накладывая ¦вокруг нее по крайней мере два якорных шва.
4. Операцию заканчивают, как описано в предыдущем разделе.
5. Канюлю укрепляют шелковыми нитками на шерсти на спине животного и в конец канюли вставляют трехходовой клапан.
6. При получении крови плода поршень шприца следует оттягивать очень мягко, так как в противном случае внутренний конец канюли может притянуться к стенке сосуда, что будет препятствовать току крови.
IV. ПРОЦЕДУРЫ in vitro
А. Фракционирование клеток
1. Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови
1. Кровь набирают в шприц, содержащий ЭДТА—2Na (концентрация ЭДТА должна быть 1,5 мг/мл крови), и тщательно перемешивают.
2. Кровь центрифугируют при 1600 g 20 мин при 4°С до образования светлого слоя кровяного сгустка.
3. Светлый слой отбирают и ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 0,75 мг/мл ЭДТА (RPMI— ЭДТА). Пастеровскую пипетку, которой отбирают светлый слой, заранее смачивают средой RPMI — ЭДТА, так как в противном
Овца как экспериментальная модель
457
случае содержащиеся в слое клетки будут прилипать к пипетке, что приведет к снижению их выхода. Из 20 мл цельной КрС”” Г0ТС?ят суспензию KjjgyoK светлого слоя в объеме 5 или 10 мл. На этой стадии следует тщательно перемешивать клетки, иначе на границе слоев градиента на этапе, описанном в п. 5, могут остаться нейтрофилы.
4. 10—12 мл клеточной суспензии наслаивают на 60%-ный раствор перколла и центрифугируют при 1600 g 20 мин при комнатной температуре. Предварительно готовят изотонический маточный раствор перколла (Pharmacia): к девяти частям перколла добавляют одну часть концентрированной (ХЮ) среды Хэнкса без Mg24" и Са2+; полученный- раствор считают 100%-ным перколлом. После этого готовят 60%-ный перколл (по объему) с использованием однократной по концентрации среды Хэнкса без Mg2+ и Са2+ (плотность 1,075).
5. Клетки собирают на границе слоев и дважды промывают их центрифугированием (300 g) в среде RPMI — ЭДТА. Для полного удаления тромбоцитов суспензию промывают еще два раза (или до просветления супернатанта) центрифугированием при 200 g в среде RPMI 1640 (без ЭДТА). При использовании этой процедуры можно ожидать получения 1,0—3,0-107 моно-нуклеарных клеток из 10 мл крови. Из них 5—10% представлены моноцитами, дающими положительную реакцию на неспецифическую эстеразу, а остальные — лимфоцитами.
2. Выделение полиморфноядерных лейкоцитов
из периферической крови
1. Сначала проводят процедуры, описанные в пп. 1—4 предыдущего раздела.
2. После удаления материала с границы слоев градиента добавляют 10 мл среды RPMI 1640 и ресуспендируют оставшиеся клетки (эритроциты и полиморфноядерные клетки).
3. Суспензию центрифугируют 10 мин при 600 g при комнатной температуре.
4. Супернатант отбрасывают, а клетки ресуспендируют в 5 мл раствора трис-ЫН4С1, подогретого до 37 °С. Все эритроциты при этом должны лизироваться в течение 15 с. (Для приготовления раствора трис-ЫН4С1 смешивают 90 мл 0,16 М NH4C1 и 10 мл 0,17 М триса; pH доводят до 7,2 с помощью НС1).
5. Добавляют 10 мл среды RPMI и осаждают клетки.
6. Перед использованием клетки дважды промывают. Более
90% полученных таким методом клеток представлены полиморфноядерными лейкоцитами.
458 Глава 24
3. Одноэтапное выделение жизнеспособных клеток
с помощью ступенчатого градиента перколла
Этот метод чрезвычайно эффективен для удаления мертвых клеток из суспензйй лимфоидных клеток, полученных из селезенки, лимфатических узлов и пейеровых бляшек.
1. Готовят, как описано выше, 75%-ный и 35%-ный растворы перколла в среде Хэнкса без Са2+ и Mg2-1-. Эти растворы могут храниться при 4°С в течение нескольких месяцев.
2. В градуированную пластмассовую пробирку наливают 3 мл 75%-ного перколла и осторожно наслаивают на него пипеткой 3 мл 35%-ного перколла. На пробирке карандашом отмечают положение границ каждого слоя. Это поможет в идентификации индивидуальных популяций клеток на каждой границе при последующих процедурах.
Предыдущая << 1 .. 200 201 202 203 204 205 < 206 > 207 208 209 210 211 212 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed