Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 20

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 14 15 16 17 18 19 < 20 > 21 22 23 24 25 26 .. 239 >> Следующая

Для того чтобы избежать нестабильности плазмиды вследствие экспрессии кДНК (см. п. 4 выше), необходимо пользоваться сильным, но жестко регулируемым промотором (полностью репрессируемым в нормальных условиях). Для достижения той же цели следует также ввести в вектор сигнал терми-нацни транскрипции.
Чтобы преодолеть трудность 3, лучше всего получить фрагмент ДНК, содержащий в своем составе промотор, последовательность Шайна — Дельгарно и инициирующий кодон AUG. Для преодоления трудности 2 (и, возможно, трудности 1; см. выше) целесообразно вставить кДНК в кодирующую область гена Е. coli. Получаемая при этом конструкция содержит кДНК в составе гена, и ее продуктом является химерная мРНК, детерминирующая синтез химерных полипептидов, которые кодируются отчасти самим геном кишечной палочки, а отчасти кДНК. Как правило, химерные полипептиды в клетках Е. coli стабильны, и, хотя они не обладают биологической активностью, они должны обладать антигенными свойствами. Этот вопрос еще будет обсуждаться в разд. IV, Б.
При конструировании комплекса кДНК—вектор возникают некоторые проблемы, связанные с получением экспрессии.
1. Ориентация кДНК- Если ориентация вставки кДНК противоположна ориентации промотора, экспрессии не происходит. Поэтому при использовании стандартного метода вставки кДНК вероятность получения правильной ориентации составляет 0,5. При использовании для синтеза кДНК метода Окаямы — Берга (Okayama, Berg, 1982) ориентация кДНК всегда является правильной.
2. Размеры кДНК Если размеры кДНК меньше, чем размеры интактной мРНК, то экспрессии не будет или же образующиеся полипептиды не будут обладать биологической активностью. Методы Окаямы — Берга и Хайдекера — Мессинга являются наилучшими для получения полноразмерных продуктов
кДНК.
Клонирование кДНК
51
Линкер Clal Линкер Prut
Pvul
Clal
/ Триптофановый промотор + УСР
CAT|CGATG [CCGATjl
gtagcJtac + ggc|ta(
SATJCGG
ffAGCC
Лигирование по тупым концам
-CAT]
- GTAGCl
Г идролиз Сla I
1cgatgccgat|gggcat[cgatg-igcItacggc [tagccgtagc|tac-
Гидролиз С fa I
|_CGATGCCGAT|CXjGCATr|
I tagcggc|tagccgtagc|
---------: v
| Лигирование | Трансформация | Скрининг Amp1, 2 сайта Pvu\, 2сайта Cla\
I
|A3CTT----/Лромотор\ - A AAGGGTATCGATGCCGAT|GGGn
Ia----уОператор ) -TTTCCCATAGCTACGGCl
УСР
Рис. 3-1. Конструирование плазмиды ptrpLM на основе плазмиды ptrpLl. Фрагмент, образующийся в результате гидролиза ptrpLM рестриктазамн Pvul и HinAlll, содержит триптофановый промотор и соответствующий участок связывания с рибосомой (УСР). Если гидролизаты, полученные с помощью Pvul, используются для наращивания oligo(dG) -концевых последовательностей до гидролиза рестриктазой tfindlll, то фрагмент, несущий промотор после рестрикции fftndlll, содержит кодон AUG непосредственно после участка связывания с рибосомой.
3. Поскольку кодоны являются триплетами, вероятность получения правильной рамки считывания по отношению к кодону AUG вектора составляет 1/3. Если может использоваться кодон AUG самой кДНК, то вероятность получения правильной рамки считывания будет значительно выше чем 1/3.
4*
Замещение участка РНК •участком ДНК с помощью РНКэзы Н, ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы Е. coli
Рнс. 3-2. Этапы конструирования рекомбинантов плазмнда—кДНК помощью метода Окаямы — Берга. В данной главе вместо фрагмента Htna\\\—Pst\, показанного на этом рисунке, обсуждается содержащий oligo(dG)-концевую последовательность PvuI—Я?пёШ-фрагмент, который несет триптофановый промотор, участок связывания с рибосомой и кодон AUG. Затравкой также является фрагмент, отличающийся от фрагмента, показанного на рисунке (ннжняя светлая дуга). Для ее получения используется плазмида pcDVJ.
Hindi II
Pvull
Клонирование кДНК
53
(0,В6> Sa/l Hind III
P8R322
ori
Рис. 3-3. Структура плазмиды pcDVl.
В этой главе будет описан метод Окаямы — Берга с моди-фицикацией, которая включает использование триптофанового промотора с участком связывания рибосомы и инициирующим кодоном, находящимся на нужном расстоянии (вместо использования описанного в оригинальной работе линкерного фрагмента).
Линкер, содержащий триптофановый промотор, был получен в соответствии со схемой, приведенной на рис. 3-1, на основе плазмиды ptrpLl (Edman et al., 1981). Небольшой фрагмент ДНК, получаемый тандемным лигированием линкера С1а\ и линкера Pvul, вставляется в C/aI-сайт плазмиды ptrpLl. Образующаяся плазмида ptrpLM содержит сайт для рестриктазы Pvul между двумя C/aI-сайтами. При синтезе dG-последова-тельности на З'-конце после гидролиза плазмиды ptrpLM под действием рестриктазы Pvul происходит формирование кодона AUG на расстоянии одиннадцати оснований «вниз» от сайта связывания с рибосомой. Расстояние между этими двумя функциональными участками является субоптимальным для экспрессии в векторах на основе триптофанового промотора (Shepard et al., 1982). Если в методе Окаямы — Берга в качестве линкера использовать фрагмент 7/mdIII — Pvul плазмиды ptrpLM, то все молекулы кДНК библиотеки будут обладать промотором, участком связывания рибосомы и кодоном AUG, и большинство клонов, включая неполные кДНК, будут экспрессироваться при индукции триптофанового оперона. Схема метода Окаямы —
Предыдущая << 1 .. 14 15 16 17 18 19 < 20 > 21 22 23 24 25 26 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed