Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Различия во включении тимидина, обусловленные культуральной средой, особенно те, которые выявляются при стимуляции культур ЛПС и кроличьими антителами против иммуноглобулинов кур, наблюдаются также при культивировании лимфоцитов периферической крови. Как было показано в ряде ¦опытов, полная среда со всеми добавками обеспечивает диффе-
Получение лимфоидных химер птиц
417
Таблица 22-1. Активация лимфоцитов в бессывороточной среде1*
Включение аН-тнмидина, имц/мнн
Митоген среда А среда Б (основная)
(со всеми добав
ками)
Контроль --- 2 675 361
Кон-А 1,25 мкг/мл 31 066 29 883
Митоген лаконоса 150 мкг/мл 27481 15719
ЛПС-f. coli 50 мкг/мл 21716 2 175
055: В5
Кр-анти-KIg 12,5 мкл/мл 16 432 2 487
Контроль (ИСК) 12,5 мкл/мл 1340 820
Клетки селезенки (Н.В21) культивировали в 200 мкл среды в луиках панелей для микротитрования (Costar 3596) при начальной плотности I ¦ 10е жизнеспособных лимфоцитов на лунку прн 40 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% СОа. 3Н-Тимидин (1 мкКн/мл) добавляли на 8 ч через 40 ч после начала культивирования. Проводили четыре параллельных измерения в независимых лунках. Отклонение от среднего значения не превышало 10%. Кр-анти-KIg — кроличьи антитела против иммуноглобулина кур; ИСК — нормальная сыворотка кровн кролика.
ренцировку колоний В-клеток и образование зон гемолиза, если клетки селезенки культивируют по методу Пэйджа и Скарволла (Paige, Skarvall, 1982, неопубликованные наблюдения).
В. Цитогенетические методики
Для идентификации лимфоцитов у химер, содержащих Т- и В-клетки с различными хромосомными маркерами, лимфоциты периферической крови культивируют в 2 мл полной среды в течение 40 ч в 24-луночных панелях для культивирования (Costar 3424) по 10-10® клеток на лунку. В качестве специфических стимуляторов размножения Т- и В-клеток используют Кон-А и кроличьи антитела к иммуноглобулинам кур соответственно. Через 2 сут культивирования долю клеток хозяина и донора, отвечающих на тот или другой стимулятор, определяли по половым хромосомам в делящихся клетках (Owen, 1965). Вкратце для этого требуются следующие манипуляции [модификация методики, описанной Мурхэдом (Moore-head et al., I960)]. Через 40 ч после культивирования в культуры на 2,5 ч добавляют колхицин [колхицин (Sigma) 0,4 мкг/мл или колцемид (Gibco) 0,25 мкг/мл]. Клетки центрифугируют в конических градуированных пробирках на 15 мл, осадок осторожно суспендируют в 0,3 мл инактивированной нагреванием сыворотки крови цыплят и аккуратно добавляют в пробирку 5 мл 0,7%-ного цитрата натрия, который выполняет роль гипотонического агента, вызывающего набухание клеток. Клет-
27—1278
418 Глава 22
ки очень осторожно перемешивают в гипотоническом растворе пастеровской пипеткой и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. После этого пробирку центрифугируют при 200 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость декантируют и полностью удаляют. К осадку осторожно приливают 2—3 мл свежеприготовленного фиксатора (3 части абсолютного метанола,
1 часть ледяной уксусной кислоты) и очень осторожно разрыхляют его кончиком пастеровской пипетки, давая возможность фиксатору полностью впитаться. Через 30 мин осадок энергично суспендируют до образования суспензии, состоящей из отдельных клеток, центрифугируют и вновь суспендируют в фиксаторе так, чтобы плотность клеток была удобна для дальнейшей работы. Объем добавляемого при этом фиксатора зависит от размера осадка и обычно составляет 1—2 мл. Вымытые хромовой смесью и тщательно промытые водой предметные стекла погружают в ледяную дистиллированную воду. Со стекла стряхивают избыток воды и помещают его на плоскую поверхность. Пастеровской пипеткой, кончик которой удален от стекла на 2— 3 см, на его поверхность наносят две капли хорошо перемешанной суспензии клеток. При проведении пламенем бунзеновской горелки над поверхностью стекла растекающиеся капли быстро испаряются. Как только стекло становится сухим, его окрашивают по Гимза или уксуснокислым орсеином и накрывают покровным стеклом. Для каждой культуры просматривают 50 метафаз. В табл. 22-2 представлены результаты типичного опыта.
Описанную выше методику используют для любых тканей, клетки которых перед этим культивировали в течение одного или нескольких дней. Тот же метод может быть использован и для прямого приготовления хромосомных препаратов из селезенки или костного мозга. Прямое приготовление означает, что обработке подлежат клетки, полученные из соответствующих органов в момент забоя животных. Промытые клетки инкубируют в среде 3—4 ч при 37 °С в присутствии колхицина и подвергают дальнейшей обработке.
