Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Б. Обработка реципиентов клеток
Реципиентами клеток служат цыплята сублинии
Н.В21Ви-1а~. Пол животных определяют на прямых препаратах хромосом из биопсий доли тимуса. Для этого только что вылупившихся цыплят наркотизируют внутримышечной (в/м) инъекцией 0,1 мл (1,5 мг на цыпленка) только что приготовленной смеси (1:1) тиопентал-натрия (22 мг/мл) и фенобарбитал-натрия (7,5 мг/мл). Разрезают кожу на спинной стороне шеи цыпленка, удаляют одну долю тимуса и на разрез накладывают скобки. Прямые хромосомные препараты готовят, как описано ниже. Сразу же после биопсии тимуса подопытным животным начинают вводить циклофосфамид. Свежеразведенный цикло-фосфамид (Mead Johnson) вводят в/м в течение четырех суток (3 мг на цыпленка в сутки; доза может немного варьировать в зависимости от используемой линии цыплят). Если не прово-
Получение лимфоидных химер птиц
41»
дить определение пола у реципиентов, то, естественно, пригодными для работы будут только 50% химер. Клетки фабрициевой сумки инъецируют реципиентам через 20-—24 ч после последнего введения циклофосфамида.
В. Приготовление клеток фабрициевой сумки
Донорами клеток фабрициевой сумки служат цыплята сублинии Н.В21Ви-1а+ в возрасте 1—4 сут. Фабрициевы сумки самцов и самок собирают отдельно. Пол доноров определяют, исследуя расположенные внутри тела ткани гонад. Фабрициевы сумки помещают в охлажденную во льду среду МСИ (Gibco 410-1500), имеющую осмоляльность 0,350, в которую были добавлены: 5% инактивированной нагреванием (56°С, 30 мин) и профильтрованной через фильтры с размером пор
0,45 мкм (Millipore) сыворотки крови цыплят, пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и гепарин (2,5— 5 ед./мл) (Liquemin, Roche, Швейцария). Гепарин препятствует избыточной агрегации клеток фабрициевой сумки. Фабрициевы сумки несколько раз споласкивают и затем ткань аккуратно измельчают в небольшом объеме среды микропрепаро-вальными ножницами (Clay-Adams С-1222) до фрагментов размером 1—2 мм. Высвобождающиеся клетки собирают и хранят во льду. Остающиеся фрагменты ткани многократно, но осторожно суспендируют в гомогенизаторе соответствующего размера с тефлоновым пестиком (А. Н. Thomas Co., 3431-Е15, размер А или В) в избытке среды, в которую из мозговых сегментов фолликулов фабрициевой сумки высвобождаются лимфоциты. Если стадию «гомогенизации» пропустить, то выход клеток фабрициевой сумки будет очень мал. При этом клетки мозговых сегментов будут полностью потеряны, тогда как известно, что они более эффективно, чем кортикальные клетки заселяют строму фабрициевой сумки цыплят, обработанных циклофосфамидом (неопубликованные наблюдения). Из фабрициевой сумки 1-суточного цыпленка можно получить прибли-зрительно 15—18-106 клеток. Объединенную клеточную суспензию оставляют на 3—5 мин для отстаивания, чтобы дать осесть крупным фрагментам ткани. Затем клетки надосадочной жидкости фильтруют через 4 слоя мелкоячеистой стерильной хирургической марли и дважды промывают в среде, после чего суспендируют в концентрации 50-106 клеток/мл, которая удобна для инъекций. В яремную вену иглой № 26 медленно вводят
0,5 мл суспензии, содержащей 25-106 жизнеспособных клеток. Образование сгустков клеток является обычно следствием поспешного приготовления суспензии без тщательного удаления фрагментов ткани или клеточного дебриса. Жизнеспособность
414 Глава 22
правильно приготовленной суспензии клеток должна составлять более чем 90%- pH среды поддерживают в интервале 7,2—7,5, продувая пробирки воздухом с 5% С02. Разумеется, клетки от доноров-самцов вводили реципиентам-самкам, а клетки от до-лоров-самок — самцам.
Г. Содержание химер
Полученные химеры очень быстро развиваются в здоровых, полностью нормальных животных и не нуждаются в специальном внимании. Однако популяции В-клеток селезенки и периферической крови, возникшие из клеток донора, быстрее увеличиваются в размерах после 1—2 инъекций антигена (0,75 мл 1%-ной суспензии ЭБ и 1:50 суспензии Brucella abortus) приблизительно на 4-й и 7-й неделе жизни (неопубликованные наблюдения).
IV. АНАЛИЗ ХИМЕР
При исследовании прямых хромосомных препаратов клеток тимуса и фабрициевой сумки Т/В-клеточных химер через
3—4 нед после переноса клеток можно показать, что размножающиеся клетки тимуса принадлежат хозяину, в то время как размножающиеся клетки фабрициевой сумки являются потомками клеток донора (Weber, 1975). Количество В-клеток хозяина и Т-клеток донора в организме химер ничтожно мало на протяжении всего времени наблюдения за ними (2,5 года химе-ризма вплоть до сегодняшнего дня). Более того, последние работы показывают, что в химерах этого типа большинство реконструированных фолликулов в фабрициевой сумке являются клональными, т. е. клеточная популяция в пределах одного фолликула возникает из одной донорской клетки (Pink et al.,
1984). Ценность химер состоит в том, что их можно многократно использовать как доноров крови, содержащей идентифицируемые Т- и В-клетки. В последние годы методы культивирования лимфоцитов, особенно В-клеток, усовершенствованы. Описание этих методов приведено ниже.
