Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
23. Смесь разбавляют добавлением по каплям 10 мл среды, не содержащей сыворотки.
24. Слившиеся клетки собирают центрифугированием при 800 g в течение 10 мин.
25. Эти клетки вносят на 1—2 дня в среды, содержащие 100 мкг/мл канамицина.
26. Добавляют соответствующие селективные среды и меняют их раз в 3 сут до завершения опыта.
Резистентные к селективным агентам клоны возникают через
1—4 нед в зависимости от типа клеток (70Z/3, 7 дней; Х63 Ag8653, 14 дней; K46R18y4gr, 3—4 нед). Поскольку чувствительность многих линий клеток к G-418 и микофеноловой кислоте не одинакова, перед опытом по трансфекции необходимо получить кривую титрования, отражающую чувствительность данной клеточной линии к селектирующему агенту. Как правило, для того чтобы убить линии В- и Т-лимфоцитов, требуются концентрации G-418, равные по крайней мере 2 мг/мл. Некоторые клеточные линии (например, пре-В-лимфоциты, В-лимфомы, цито-токсические Т-лимфоциты) имеют узкий диапазон чувствительности к G-418. Во многих опытах с клеточными линиями K46R18y4gr и 70Z/3 селекция при концентрации G-418 2 мг/мл не приводила к селекции пеог-клонов, в то время как селекция при концентрациях G-418 1,5 и 1 мг/мл давала много клонов. Однако эти концентрации G-418 находятся на уровне порога (прорыва) чувствительности. Для того чтобы убедиться в пе-
46 Глава 2
редаче генов, необходимо провести простой тест [биологический тест или опыты типа дот-блот ДНК с использованием pBR-322 в качестве зонда (Kafatos et al., 1979; Collins, Grondine, 1983)]; это необходимо для того, чтобы подтвердить наличие стабильной трансформации.
, Трансформанты должны поддерживаться в селектирующих условиях. Метод слияния с протопластами бактерий часто обеспечивает наследование множественных копий гена, переданного с помощью трансфекции (10—50 копий на геном) (McCub-геу et al., 1985). Если такие клоны выращивать в неселектирующих условиях, то примерно четверть всех субклонов, которые вначале имели по 50 копий гена, потеряют все эти копии в пределах двух месяцев культивирования (McCubrey, неопубликованные результаты). Напротив, клоны, содержащие лишь немногочисленные копии генов (1—5), являются относительно стабильными, и они не теряют ген даже при выращивании в течение 6 мес в неселектирующих условиях.
Если исследователь заинтересован в анализе РНК, образуемой трансформантами, содержащими вектор с последовательностями плазмиды pBR322, не следует пользоваться зондами, которые содержат pBR322. Многие трансформанты образуют РНК, которая содержит последовательности плазмиды pBR322, и в результате могут быть получены ошибочные данные.
IV. ДРУГИЕ МЕТОДЫ СТАБИЛЬНОГО ПЕРЕНОСА ГЕНОВ
Недавно было описано много новых методов для получения стабильного переноса генов: использование векторов на основе ретровирусов (Shimotohno, Temin, 1981), слияние с липосомами (Schaefer-Ridder et al., 1982), слияние с мембранами эритроцитов (Wiberg et al., 1983), метод мембранного укола (Yamamoto et al., 1981), электрический шок (Neumann et al., 1982) и прямая микроинъекция ДНК (Capecchi, 1980). Как отмечалось ранее, многие лимфоидные линии не удается трансформировать с помощью слияния с протопластами бактерий. В таких случаях можно попытаться использовать другую методику.
Литература
Banerji Olson L„ Schaffner W. (1983). Cell, 33, 729—740.
Capecchi M. R. (1980). Cell, 22, 479—483.
Colbert-Garapin F., Horodniceanu F., Kourilsky P., Gaparin A.-C. (1981) J. Mol. Biol., 150, 1—4.
Collins S. I., Groudine М. T. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 4813— 4817.
Gillies S. D„ Morrison S. L., Oi V. Т., Tonegawa S. (1983). Cell, 33, 717— 728.
Трансформация лимфоидных клеток с помощью ДНК_________________________________47
Cooumow R. S., McMillan М., От A., Nicolson М., Davidson N.. Frelinger J. А., Hood L. (1982). Science, 215, 677—679.
Graham F. L., van der Eb A. J. (1973). Virology, 52, 456—467.
Hedricf\s. M„ Cohen D. /., Nielsen E. A., Davis М. M. (1984). Nature (London), 308,\l49—153.
Kafatos Д., Jones C., Efstradtiadis A. (1979). Nucleic Acids Res., 7, 1541—1552. Kavathas'PHerzenberg L. A. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 524— 528. N
McCubrey J., McKearn J. P., Kohler G. (1985). Eur. J. Immunol, (in press). Mulligan R. C., Berg P. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072—2076. Neuberger M. S. (1983). EMBO J., 2, 1373—1378.
Neumann E., Schaefer-Ridder M„ Wang Y., Hofschneider P. H. (1982). EMBO J., I, 841—845.
Oi V. Т., Morrison S. L., Herzenberg L. A., Berg P. (1983). Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 80, 825—829.
Queen C., Baltimore D. (1983). Cell, 33, 741—748.
Schaefer-Ridder М., Wang Y., Hofschneider P. H. (1982). Science, 215, 166— 168.
Schaffner W. (1980). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2163—2167.
Shimotohno K., Temin H. M. (1981). Cell, 26, 67—77.
Southern P. J., Berg P. (1982). J. Mol. Appl. Genet., 1, 327—341.
Wiberg F. C„ Sunnerhagen P., Kaltoft K., Zeuthen J., Bjursell G. (1983). Nucleic Acids Res., II, 7289—7302.
Wigler М., Silverstein S., Lee L.-S., Pellicer A., Cheng Y.-C., Axel R. (1977). Cell, 11, 223—232.
