Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 17

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 239 >> Следующая

K46R18i4gr
В-миелома
Х63 Ag8.653 12
574 1/10* 2
J558L 1/10» 3
Т-лимфоциты 8
BW5147i4gr 1/10»
Макрофаги
Р3887>/ 1/10» 7
Тератома 8
РСС4 Ag' 1/Ю4
Фибробласт 8
Ltk- 1/106
NIH-3T3 1/10® 3
Клеточные линии, которые не удалось стабильно трансформировать к фенотипу пеог *>
Пре-В-лимфоциты Макрофаги
220-8 (3) 1VEHI-3 (2)
223-18 (3) Т-лимфоциты
230-238 (6) EL4 BiT Оиаг (1)
230-37 (3) EL4-1976 Bur (3)
В-лимфома RAT-T (3)
А-20 (5) MOLT-4 (3)
VVEH1-231 (2) Прочие
В-миелома Опухоли гипофиза (2)
SP2/0 (5)
Y/0 (2)
') В скобках указано число опытов.
каждой из клеточных линий, у которых мы смогли получить стабильные трансформанты с помощью данной методики, представлены в табл. 2-1; там же приведена информация о клеточных линиях, у которых нам не удалось получить стабильные трансформанты. Ряд авторов (Gillies et al., 1983; Oi et al.,
1983) добился большого успеха с некоторыми из клеточных линий, перечисленными в данной таблице, однако они также потерпели неудачу при попытках трансформации некоторых из
44 Глава 2
этих линий. Создается впечатление, что частота стабильной трансформации различна для разных лабораторий, и даже сублинии, получаемые в одной и той же лаборатории, варьируют по частоте трансформации. Поэтому нужно работать с клеточной линией независимо от того, что о ней было опубликовано в литературе, и надеяться на лучшее.
Использованная методика кратко описана ниже.
1. Исследуемый ген включают в вектор для переноса генов (Mulligan, Berg, 1981; Southern, Berg, 1982), содержащий доминантный селектируемый маркер, функционирующий в эукариотических клетках (например, tk, пеот, gpt).
2. Трансформируют подходящий штамм бактерий (например, Е. coli 803) с помощью вектора для переноса генов.
3. Выращивают бактерии с плазмидным вектором в суспензионных культурах (100 мл), используя L-бульон, содержащий 20 мкг/мл ампициллина (если вектор содержит ген ampr), до оптической плотности Аб5о=0,2.
4. К культурам добавляют хлорамфеникол (конечная концентрация 100 мкг/мл, Sigma), для того чтобы увеличить число копий плазмиды.
5. Культуры инкубируют в течение ночи при 37 °С в условиях сильного встряхивания.
6. Бактериальные клетки собирают с помощью центрифугирования (6000 g, 10 мин). Бактериальная культура объемом 100 мл дает достаточное количество протопластов, по крайней мере для 10 опытов по слиянию. Приводимые ниже количества относятся к одной культуре объемом 100 мл.
7. Осадок бактерий ресуспендируют в 10—20 мл 50 мМ трис-НС1, pH 8,0, содержащего 20%-ную сахарозу.
8. Промытые бактерии собирают центрифугированием (6000 g, 10 мин).
9. Осадок бактерий ресуспендируют в том же буфере (2,5 мл).
10. Добавляют 0,5 мл раствора лизоцима (Sigma, 1 мг/мл в 0,25 М трис-НС1, pH 8).
11. Суспензию инкубируют во льду в течение 5 мин.
12. К суспензии бактерий добавляют 1 мл 0,2 М ЭДТА, pH 8, и аккуратно перемешивают.
13. Инкубируют суспензию во льду еще 5 мин.
14. Медленно по каплям добавляют 1 мл 50 мМ трис-НС1, pH 8.
15. Раствор инкубируют при 37 °С до полноты образования протопластов. Обычно это занимает 30 мин.
16. По каплям добавляют к суспензии протопластов 10 мл среды МСИД, содержащей 10% сахарозы и 12,5 мМ MgCl2. Пробирку осторожно перемешивают вращением. Необходимо
Трансформация лимфоидных клеток с помощью ДНК
45
соблюдать осторожность и следить за тем, чтобы протопласты не лизировались. Если среда меняет цвет с красного на желтый (изменение pH, обусловленное лизисом протопластов), то выход протопластов, пригодных для опыта по слиянию, будет небольшим.
17. К раствору с протопластами добавляют 0,1 мл ДНКазы (1 мг/мл) и инкубируют при комнатной температуре 30 мин.
18. Протопласты собирают с помощью центрифугирования (2500 g, 30 мин).
19. Клетки реципиента (2-107—108 эукариотических клеток) сажают на протопласты (1/10 объема протопластов). Подходящим является соотношение между протопластами и эукариотическими клетками ~ 100:1. При более высоких отношениях эукариотические клетки гибнут.
20. Протопласты и эукариотические клетки смешивают, осторожно постукивая пальцем по пробирке.
21. Проводят слияние в присутствии 40% ПЭГ 1000 (Merck), 10% ДМСО (Merk) и 50% МСИД в течение 30 с. ПЭГ добавляют по каплям, встряхивая и вращая пробирку.
22. Проводят слияние в присутствии 50% ПЭГ 4000 (Merck) и 50% МСИД в течение 30 с.
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed