Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
2. Смесь, содержащую ДНК, разбавляют пятикратным или двукратным буфером ГЭПЭС до конечной концентрации буфера, равной IXГЭПЭС (1ХГЭПЭС представляет собой раствор 0,14 М NaCl, 0,005 М КС1, 0,004 М Na2HP04-2H20, 0,01 М декстрозы, 0,02 М ГЭПЭС, pH 7,05).
Преципитат CaP04 - ДНК
Слияние с бактериальными протопластами
ДНК (опытная) ДНК (носитель) IX ГЭПЭС 0,125 М СаС12
Фи броб ласты
Добавить к монослою клеток ГГ
Г
В пробирке
30 мин
23° С = _1
4^7
i
Инкубировать 4 ч при 37° С
1
Непри к ре пившиеся клетки
Ре суспендировать клетки с преципитиро-ванной ДНК в центрифужной пробирке объемом 50 мл
Инкубировать кпетки (в пробирке)
30 мин, 37° С
Удалить среду
Разбавить в нормальной среде, высеять на пластинки для микротитрования с 24 лунками
^ I Через 1 день
Добавить 15% ДМСО Ў
или 15% сахарозы Добавить селективные
среды
Через 2—3 нед
30 мин, 37 С
I
Промыть
I
Выделить
трансформанты
Добавить нормальные среды ^Через 1 день Добавить селективные среды Через 2—3 нед
I'
ь сел
I'
1
Выделить трансформанты
Стабильно трансформируемы* клетки
Фибробласты Макрофаги В-лимфоциты } )
Вырастить бактерии с необходимой плазмидой
1
Добавить хлорамфеникол
^ Инкубация в течение ночи Собрать бактерии
(2>-*0 По пучить протопласты (с помощью лизоцима)
Слить с эукариотическими клетками (ПЭГ-4000)
Высеять на нормальные средь с канамицином
I
Через 1 день
‘Высеять на селективные среды с канамицином
^ Через 2-3 нед
Выделить трансформанты
!
Стабильно трансформируемые клетки
Фибробласты Макрофаги В-лимфоциты Т-пимфоциты Клетки меланомы Клетки тератомы
Рис. 2-1. Методы переноса генов с помощью копреципитации ДНК с фосфатом кальция и слияния с бактериальными протопластами.
42 Глава 2
3. К раствору, содержащему ДНК, добавляют одну десятую объема 1,25 М СаС12 так, чтобы конечная концентрация хлористого кальция составляла 0,125 М. Раствор оставляют на
0,5 ч при комнатной температуре для формирования осадка.
4. Сливают среду с клеток (обычно это фибробласты), которые были засеяны накануне в количестве 5-105 клеток в 10 мл среды в чашках Петри диаметром 100 мм.
5. Добавляют ДНК, соосажденную с СаР04. Чашку аккуратно покачивают для равномерного распределения осадка, после чего помещают в инкубатор при температуре 37 °С с газовой фазой, содержащей 5% СОг.
6. После инкубации в течение 10 мин добавляют 9 мл нагретой до 37 °С полной среды и чашки инкубируют при 37 °С в атмосфере с 5% СОг в течение 4—6 ч.
7. Среду сливают, добавляют 15%-ный ДМСО (в среде культивирования) или 15%-ную сахарозу (в среде культивирования), чтобы вызвать шок у клеток, и инкубируют чашки в течение 0,5 ч при 37 °С в атмосфере с 5% СОг. После шокового воздействия, которое приводит примерно к двух-трехкратному увеличению частоты трансформации в случае линии фиброблас-тов, клетки отмывают средой. Однако такие процедуры зачастую токсичны для линии лимфоидных клеток.
8. Через 1—2 дня добавляют необходимую селективную среду (в зависимости от того, какой из доминантных маркеров был использован). Трансформанты фибробластов можно видеть примерно через 7 дней после добавления ДНК. Их изолируют [при наличии достаточного количества клеток (от 100 до 1000)] с помощью цилиндров для клонирования (отрезки стеклянной трубки с размерами 2x1 см). Можно также наращивать трансформанты в большом количестве и далее подвергать их скринингу на нужный фенотип.
Описанная выше методика полезна при трансформации фибробластов, однако Т- и В-лимфоциты не поддаются трансформации с помощью этого метода. Обычно в случае Т- и В-лим-фоцитов обнаруживаются лишь немногочисленные копии использованного для трансформации гена. Поэтому для обеспечения совместного наследования доминантного селектируемого маркера и неселектируемого гена онн должны быть подвергнуты молекулярному лигированию или же включены в вектор для переноса генов.
Б. Слияние бактериальных протопластов
Последовательность процедур этой методики исходно разработанной Шаффнером (Schaffner, 1980), схематически представлена на рис. 2-1. Частоты стабильных трансформантов для
Трансформация лимфоидных клеток с помощью ДНК
43
Таблица 2-1. Частота клеток, стабильно трансформированных к фенотипу пес?
Линия клеток Частота стабильных Число опытов
трансформантов
Пре-В-лимфоциты 1/Ю7
204-3-1 7
70Z/3 1/1°: 8
18-81 1/10* 8
В-лимфома 1/10» 8
