Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 131

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 125 126 127 128 129 130 < 131 > 132 133 134 135 136 137 .. 239 >> Следующая

V. РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
Основное различие между работой на цитометре в аналитическом режиме и на сортере состоит в том, что во втором случае ставится задача сбора проанализированных клеток. При этом обычно исследуют (и соответственно готовят для анализа) гораздо большие количества клеток, чем для работы в аналитическом режиме.
А. Общие положения
В процессе подготовки и при самом сортинге клетки под-вергаются разнообразным нежелательным воздействиям. Поэтому в ходе всех процедур необходимо стремиться к сохранению максимально благоприятных условий для клеток.
1. Выбор сред
Среды, с которыми контактируют клетки, содержатся в различных резервуарах: 1) в пробирках для образцов; 2) в резер-вуарах с формирующей поток жидкостью; 3) в пробирках для; сбора клеток после сортировки. Среда в пробирках для образ-цов должна содержать все необходимые для клеток ингредиенты, включая сыворотку и другие белки. Как правило, при приготовлении образцов клеток для сортинга азид натрия из состава среды исключают. Поскольку во многих случаях формирующая поток жидкость не должна содержать флуоресцирующих молекул, белки в эту жидкость не добавляют. Обычно мьь
22—1278
338 Глава 20
используем сбалансированный солевой раствор без добавления фенолового красного, если нет каких-либо особых причин, исключающих этот вариант. Пробирки для сбора клеток после сортинга должны содержать некоторое количество среды, для того чтобы избежать потерь клеток. На каждую отобранную клетку, как правило, приходится по три капли формирующей поток жидкости (т. е. исходная среда разбавляется), а эта жидкость чаще всего не содержит белка. В среду для сбора клеток мы добавляем 20% сыворотки, тогда как некоторые исследователи используют даже 100%-ную сыворотку. Если такой средой наполнить пробирку для сбора клеток на 20% объема, то конечная концентрация сыворотки после завершения сортинга не окажется слишком высокой.
2. Температура
Большинство клеточных сортеров снабжено приспособлениями для поддержания постоянной температуры, высокой или низкой. Какая бы ни была температура, главное, чтобы ее хорошо переносили клетки. Окрашенные клетки, которые могут терять свой антиген, следует разделять на холоду. Когда нам приходится использовать маленькие пробирки (пробирки Falcon 2052 на 4 мл), мы замораживаем приблизительно по 1 мл среды на дне пробирки, помещая ее в сухой лед. Замерзшая среда тает при сборе клеток, благодаря чему поддерживается низкая температура.
3. Пробирки для сбора клеток
Приспособление для сбора клеток на цитометре FACS сконструировано для работы с пробирками на 15 мл (Falcon 2095), однако без больших затруднений в них можно вставлять пробирки меньших размеров, например 12x75 мм (Falcon 2052) или подобные им. Преимущества использования больших пробирок очевидны. Первое из них состоит в том, что пробирки не нужно часто менять. При сортинге с высокой скоростью, когда в короткие промежутки времени собирают значительные количества клеток, большие пробирки наиболее удобны. При сортинге небольшого числа клеток (менее 2-106) мы предпочитаем маленькие пробирки, так как в случае неожиданного сбоя, например при засоре наконечника, который отклоняет поток в пробирку, куда собираются клетки, риску подвергается только небольшая порция клеток, находящаяся в одной маленькой пробирке.
Методы сортировки клеток в иммунологии
339*
Б. Стерильные условия
Во многих случаях, например при использовании отсортированных клеток в функциональных тестах, необходимо разделять клетки в стерильных условиях.
1. Стерилизация соединительных трубок
Важнейшим фактором для поддержания стерильных уело-вий сортинга является стерилизация соединительных трубок. Нам удавалось получать отличные результаты, используя «стерилизующий» водный раствор ДСН (0,1%) и азида натрия (0,1%).
1. Жидкость, формирующую поток, заменяют стерилизующим раствором (0,1% ДСН и 0,1% №N3 в воде) и оставляют раствор в трубках на ночь (если необходима быстрая стерилизация, продолжительность такой обработки можно сократить до 15 мин). После этого трубки тщательно промывают водой и изотоническим буфером и заполняют их средой, в которой будет проводиться сортинг.
2. Непосредственно перед внесением клеток трубки для образцов промывают хлорным отбеливателем (хорошие результаты дает средство Chlorox), после чего их дополнительно споласкивают 70%-ным спиртом. Затем их тщательно промывают, пропуская через них формирующую поток жидкость (она должна быть той средой, которая выбрана для сортинга клеток) в стерильную пробирку для образца. В результате трубки для образцов оказываются промытыми с внутренней и внешней сторон.
2. Сортинг в стерильных условиях
Выполнение перечисленных далее процедур гораздо менее важно для поддержания стерильных условий сортировки, чем стерильность трубок. Однако для того, чтобы иметь дополнительную страховку от загрязнений, обычно используют перечисленные ниже меры предосторожности.
1. Рабочую поверхность стерилизуют 70%-ным спиртом или средством Hycolin.
Предыдущая << 1 .. 125 126 127 128 129 130 < 131 > 132 133 134 135 136 137 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed