Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Б. Выбор флуорохрома
Выбор флуорохрома зависит от многих факторов, в частности от того, какой флуорохром способен детектировать данный цитометр. Идеальный флуорохром должен обладать еле-
Методы сортировки клеток в иммунологии
333
дующими свойствами: 1) возбуждаться при нужной длине волны (например, при длине волны, излучаемой ионным лазером);
2) легко связываться с белками; 3) обладать низким уровнем неспецифического связывания (окрашивания); 4) иметь высокий квантовый выход, т. е. при получении энергии (за счет возбуждения фотоном) он должен с большой вероятностью отдавать энергию за счет флуоресценции; 5) его излучение должно лежать в диапазоне максимальной чувствительности фотодетек-тора; 6) длины волн излучаемого при его флуоресценции света не должны совпадать с длинами волн «аутофлуоресценции» (флуоресценции молекул, присутствующих в анализируемых клетках, но не имеющих отношения к флуорохрому); наконец, 7) должна существовать возможность использования данного флуорохрома одновременно с другими флуорохромами в одном опыте. Короче говоря, идеальный флуорохром должен быть удобен при использовании, давать легко детектируемый и отличимый от фона сигнал и позволять применение одновременно с ним других флуорохромов.
Стандартным флуорохромом, применяемым в проточной цитометрии, стал флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) благодаря тому, что он обладает многими из перечисленных выше свойств, а также тому, что он доступен. Самым серьезным недостатком ФИТЦ является то, что клетки некоторых типов (например, клетки, культивированные in vitro) интенсивно флуоресцируют в области эмиссии ФИТЦ, и то, что квантовый выход для ФИТЦ невелик. Тем не менее с ФИТЦ удобно работать, и в большинстве случаев для него характерны высокие отношения сигнал/фон.
Другая группа флуорохромов, используемых в цитофлуори-метрии, включает производные родамина: TRITC, XRITC и появившийся совсем недавно «техасский красный» (ТК). Они излучают в желтой и красной частях спектра и часто применяются в паре с ФИТЦ при двойном окрашивании. Из этих трех флуорохромов наибольшим числом недостатков обладает TRITC. Хотя он хорошо присоединяется к белкам и легко детектируется на большинстве клеточных сортеров, меченные им реагенты дают высокий фон неспецифического окрашивания. TRITC-конъюгаты редко дают лучшие отношения сигнал/фон, чем ФИТЦ-конъюгаты. Высокое фоновое окрашивание свойственно также и для XRITC-конъюгатов, но его можно уменьшить при помощи системы авидин — биотин, как описано ниже. Вместе с тем реагенты, конъюгированные с ТК, характеризуются низкими уровнями неспецифического окрашивания. Этот флуорохром отвечает многим требованиям, предъявляемым к идеальному реагенту для флуоресцентного мечения, но с ним не очень удобно работать. Некоторые исследователи отмечают, что им не
334 Глава 20
удавалось получить конъюгаты некоторых моноклональных антител с ТК. Тем не менее ТК стали часто использовать в опытах с двумя (или несколькими) флуоресцентными метками.
Недавно появилось новое семейство флуорохромов — так называемые фикобилиновые белки. Их чаще всего используют в опытах с двумя или большим числом меток. Для них характерны высокие квантовые выходы, и они обладают рядом полезных спектральных свойств.
Биотин и авидин являются нефлуоресцирующими молекулами, которые обладают высоким сродством друг к другу. Они легко присоединяются к антителам и многим флуорохромам. Чаще всего биотин конъюгируют с антителами, а авидин — с флуорохромами. Обычно клетки сначала инкубируют с био-тинилированными антителами, а затем с конъюгатом флуоро-хром-авидин (как это делают при непрямом способе детектирования). С помощью этого метода можно выявлять антитела по флуоресценции разного цвета в зависимости от используемого для конъюгации с авидином флуорохрома. Более важным, однако, является то, что система авидин — биотин часто позволяет решить проблему мечения антител определенными флуорохромами. Поскольку биотин относительно легко конъюгирует с антителами, а авидин — с большинством флуорохромов, даже в тех случаях, когда не удается непосредственно присоединить флуорохром к антителам, их можно выявлять непрямым способом.
IV. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ
В различных лабораториях образцы для проточной цитометрии готовят по-разному. К тому же из-за все возрастающего разнообразия областей применения цитометрии (например, для определения потенциала мембран или анизотропии эмиссии) способы окраски клеток также сильно различаются. В данной главе рассматриваются методы приготовления препаратов, предназначенные для «окрашивания» поверхности клеток «традиционными» реагентами, какими являются антитела.
А. Приготовление клеточных суспензий
Основное и наиболее важное требование для сортировки клеток состоит в том, что клетки должны быть диспергированы и не должны образовывать агрегатов. С агрегатами клеток нельзя работать, так как они забивают наконечник, что является серьезной проблемой при разделении клеток; правда, при аналитических определениях ее значение гораздо меньше. Кро-
