Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
После выбора окна сортер может производить два действия: сортировать клетки и хранить данные о популяции клеток. В случае сортинга можно установить окна для двух субпопуляций клеток. Один набор параметров дискриминации будет приводить к сортировке клетки налево, а другой-—направо. Клетки, параметры которых не подходят ни к одному из окон или слишком сходны для дискриминации, не сортируются. Руководит этими решениями блок обработки сигналов, который подает на оптическую скамью «приказы» о том, куда направить клетку. Вторая функция, которую осуществляет блок обработки сигналов, — это посылка данных в блок хранения.
В. Разделение клеток
После того как проанализированы данные о клетке и принято решение о том, как она будет дискриминироваться, ее помещают в нейтральную каплю или в каплю, которой придается положительный или отрицательный заряд. Капля проходит между противоположно заряженными электродами, к которым подведено высокое напряжение, и отклоняется вправо или влево в зависимости от своего заряда. Наконечник форсунки колеблется с высокой частотой, благодаря чему поток разбивается на капли. Точка отрыва капель, однако, находится на значительном расстоянии от точки, в которой производится измерение, и именно в точке отрыва капле придается заряд. Поэтому между моментом измерения и моментом придания заряда капле имеется определенная задержка. Продолжительность задержки можно определить и затем ввести эту информацию в сортер. Тем не менее определенная доля клеток будет попадать в предшествующую и последующую по отношению к расчетной капли. Для того чтобы увеличить выход сортируемых клеток, обычно отбирают (т. е. отклоняют с помощью электродов) не одну, а несколько капель (мы обычно используем три) на каждую отбираемую клетку.
Любопытная ситуация создается, если ненужная по характеристикам клетка попадает в одну из соседних с отбираемой ка-
Методы сортировки клеток в иммунологии
331
пель. Сортер FACS II в этой ситуации может реагировать двумя способами: 1) ни одна из капель не отбирается (мы называем этот вариант «ограничивающим») и 2) нежелательная капля не отбирается, а другие капли сортируются (вариант «без ограничений»), Сортинг в ограничивающем режиме приводит к отбрасыванию многих требуемых клеток, но в результате дает более чистые препараты клеток. Вместе с тем при сортин-ге без ограничений получают больший выход нужных клеток и менее чистые препараты из-за того, что при отборе допускается больше ошибок. Этот эффект выражен в наибольшей степени при относительно высоких скоростях пропускания клеток (около 3000 клеток/с), так как при таких скоростях достаточно велика вероятность попадания двух клеток в соседние капли, что может существенно сказаться на результатах. В связи с тем что чистота получаемого препарата клеток и выход нужных клеток зависят от скорости сортинга, обычно устанавливают максимальную скорость пропускания, при которой режимы сортировки с ограничениями и режим без ограничений дают одинаковые результаты. Наиболее сложная для сортера задача — это выделение малопредставленной субпопуляции клеток в достаточно чистом виде в разумный по продолжительности промежуток времени.
Г. Хранение данных
Вне всяких сомнений, самый удобный вариант хранения информации— это использование ЭВМ (на магнитной ленте или диске). Если есть соответствующее математическое обеспечение, то экспериментальные данные можно вызывать и анализировать без каких-либо затруднений. Иногда хранят «необработанные» данные (называемые также распечатками) по каждой клетке. Впоследствии можно использовать различные методы анализа этих данных. Можно строить гистограммы, задавать параметры дискриминации и т. д. Обычно данные представляют в виде распределений частот встречаемости одного или двух параметров. Эти распределения (называемые также гистограммами или профилями) можно хранить вместо необработанных данных. Построение гистограмм по одному параметру подробно обсуждается в разд. VII, А. Выбор варианта хранения данных зависит от того, какой тип анализа будет в дальнейшем проводиться. Поскольку гистограммы занимают намного меньше места, чем полные распечатки, часто выбирают именно этот тип хранения данных. В целом хранение полных распечаток нужно только для анализа клеток по многим параметрам.
332 Глава 20
111. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
Хотя вопросы очистки и мечения связывающихся с лигандами молекул достаточно подробно обсуждались другими авторами (L. Form «Immunological Methods», v. 1), здесь следует отметить некоторые моменты, имеющие значение для проточной цитометрии.
А. Специфичность реагентов
Одна из наиболее трудных проблем при цитометрии связана с неспецифическим окрашиванием. Клеточный сортер с чрезвычайно высокой чувствительностью детектирует флуоресцирующие молекулы — обычно с большей, чем глаз. Поэтому реагенты, используемые при работе с сортером, должны быть более высокой степени очистки, чем для других методов анализа. Как правило, гетерологичные сыворотки должны подвергаться очистке на аффинных сорбентах даже в тех случаях, когда они достаточно специфичны для непосредственного использования при флуоресцентной микроскопии. Моноклональные антитела не всегда требуют очистки. Мы с успехом использовали супернатанты многих продуцирующих моноклональные антитела гибридом, которые культивировали в средах с добавлением и без добавления сыворотки, а также асцитные жидкости (конечно, в соответствующем разведении). В случае непрямых методов флуоресцентного окрашивания влияние контаминирую-щих молекул в культуральных жидкостях сводится к минимуму. Если конъюгированные с флуорохромом антитела строго специфичны по отношению к иммуноглобулинам, то даже при связывании клетками молекул, не относящихся к иммуноглобулинам, эти молекулы не будут детектироваться (по флуоресценции). В случае применения асцитных жидкостей активность моноклональных антител обычно настолько высока, что эффекты контаминирующих иммуноглобулинов и других компонентов чаще всего не выявляются. Однако при прямом конъ-югировании препаратов антител с флуорохромом наличие в них белковых примесей неиммуноглобулиновой природы может стать причиной высокого уровня неспецифического окрашивания. Следовательно, любой конъюгат используемый при сортин-ге клеток, должен быть тщательно очищен.
