Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
21—1278
322 Глава 19
Таблица 19-1. Стратегия обнаружения ревматоидного фактора IgG-класса, специфичного к IgG-антигену11
Адсорбируе Второй этап Третий этап Примечания
мый антиген
IgG, \ РФ-IgG, X *Анти-и Можно обнаружить
Fc-фрагмент РФ-IgG •Анти-Fab только ревмато
IgG РФ-IgG (обработанный идные факторы,
пепсином) имеющие х-цепи
P®-IgG-F(ab') г-стандарт Можно обнаружить
Конкуренция только аутоанти
тела против
Fc-фрагмеита
Можно обнаружить
только ревмато
идные факторы,
которые связыва
ются с теми же
эпитопами, что и
стандарт
Требуется обработка
проб пепсином
Стратегия обнаружения ревматоидных факторов IgM- или IgA-классон, специфичных к IgG-антигену
IgG РФ-IgM *Анти-ц
РФ-IgA *Анти-а
') После каждого нз перечисленных этапов производят промывку.
А. Очистка мышиного IgM из асцитной жидкости
К Ю мл мышиной асцитной жидкости, содержащей IgM, добавляют 3,2 г сухого сульфата аммония, перемешивают 1 ч при 4 °С и оставляют на ночь во льду (для более полного осаждения). Смесь центрифугируют при 12000 g 15 мин и осадок растворяют в 5 мл ЗФР. Раствор диализуют против 20 мМ трис-НС1, pH 8,0, при 4°С до полного уравновешивания. При этом нужно оставить в диализном мешочке «избыточное» пространство, чтобы во время диализа объем раствора мог увеличиться. В этих условиях IgM выпадает в осадок, который смывают со стенок мешочка струей буфера (20 мМ трис-НС1, pH 8,0), собирают центрифугированием и суспендируют в 0,2 М NaCl, 20 мМ борате, pH 8,2. Чистота препарата IgM должна составлять по крайней мере 90%.
Б. Приготовление антител к ц-цепям
Высококачественные поликлональные кроличьи антитела к IgM человека и мыши, выпускаемые различными фирмами, можно использовать после соответствующей обработки. Примес-
Клетки, синтезирующие ревматоидный фактор
323
ные антитела удаляют, пропуская коммерческие препараты через аффинные колонки, которые содержат IgG, очищенный хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. [Приготовление таких колонок описано ранее (March et al., 1974).] Затем сыворотку очищают на приготовленной сходным образом колонке с IgM. Ее медленно пропускают через IgM-колонку при комнатной температуре в течение 30 мин. Колонку промывают двумя объемами ЗФР и специфически связанные антитела элюируют одним объемом колонки 3 М KSCN. Элюат диализуют против несколько смен ЗФР и дополнительно очищают и концентрируют преципитацией сульфатом аммония при 40% насыщения. Осадок растворяют в ЗФР и перед иодированием диализуют против этого раствора до полного уравновешивания.
В. Иодирование антител к ц-цепям с помощью хлораминового метода
В основу этого метода положена процедура, предложенная Хантером (Hunter, 1970). Все операции необходимо выполнять в защитных настольных боксах или вытяжных шкафах. Компоненты смешивают в следующем порядке:
100 мкл антител к р,-цепям (50 мкг) в ЗФР 20 мкл 0,5 М фосфата натрия, pH 7,4 16 мкл (5-10-5 М) KI в Н20
5 мкл (100 мКи/мл) Na12SI (уд. акт. ~15 мКи/мг) в 0,1 М NaOH
20 мкл хлорамина-Т (2 мг/мл) в Н20 Смесь инкубируют 5 мин при комнатной температуре, добавляют 20 мкл раствора метабисульфита натрия в воде ( 4мг/мл) и инкубируют еще 2 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь обессоливают, пропуская ее через колонку с сефадексом G-25 объемом 10 мл, уравновешенную ЗФР—1%-ным БСА. Собирают пик, соответствующий свободному объему колонки, разбавляют его до 3 мл, разливают на аликвоты и хранят при —20 °С. Удельная активность должна составлять по крайней мере I07 имп/(мин-мкг антител).
Г. Очистка мышиного IgG на ДЭАЭ-целлюлозе
Исходный материал представляет собой асцитную жидкость мышей, инъецированных клетками гибридомы, вырабатывающими IgG. Антитела осаждают добавлением 3,2 г сухого сульфата аммония к 10 мл асцитной жидкости при осторожном перемешивании в течение 1 ч при 4 °С и инкубируют смесь в течение ночи на холоду. Осадок собирают центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин и растворяют в половине ис-
21*
324 Глава 19
ходного объема 20 мМ трис-НС1-буфера, pH 8,0. Пробу диали-зуют против 20 мМ трис-НС1-буфера, pH 8,0, и наносят на ДЭАЭ-колонку, уравновешенную тем же буфером. На 5 мл наносимой пробы берут 10 мл ДЭАЭ-целлюлозы. Колонку промывают двумя объемами 20 мМ трис-НС1-буфера, pH 8,0, и элюируют фракцию IgG, нанося на колонку 1,5 объема 20 мМ трис-НС1-буфера, pH 8,0, содержащего 70 мМ NaCl.
