Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Клетки, синтезирующие ревматоидный фактор
319
Усиливающие антитела, нг/мл
Рис. 19.1. Количественный гемолитический тест. Способность очищенных IgM-aHTH-IgGl (22С9) или IgG3-aHTH-IgGl (411Н12) инициировать компле-мент-зависимый лизис БЭ, конъюгированных с арс, в присутствии (темные символы) или в отсутствие (светлые символы) IgGl-анти-арс.
зывающую изотипы, аллотипы или легкие цепи исследуемого РФ, но не антител-мишеней, используемых для покрытия эритроцитов.
III. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗОН ГЕМОЛИЗА1»
Метод, описываемый в настоящей главе, представляет собой модификацию уже известных способов определения зон гемолиза (Vaughan et al., 1976; Taylor-Upsahl et al., 1977). Описаны два различных способа: агаровый метод (Jerne, Norgin,
*> Предлагаемый здесь метод принципиально отличается от методики Дрес-сера (Dresser, 1978), согласно которой антитела-мишеии непосредственно присоединяют к эритроцитам с помощью хлорида хрома и проявляют зоны гемолиза антисывороткой к (г-цепям. По данным, полученным с помощью методики Дрессера, более чем 50% антителосекретирующих клеток в культурах селезенок мышей, получавших ЛПС, являются продуцентами ревматоидного фактора. Мы думаем, что большинство зон гемолиза, образующихся при использовании методики Дрессера, являются артефактами, обусловленными неполнотой абсорбции анти-р,-сыворотки, и поэтому мы не рекомендуем использовать эту методику.
320 Глава 19
1963) в модификации Гроновича (Gronowicz et al., 1976) и метод Каннингема с использованием монослоя клеток в жидкой ¦среде (Cunningham, Szenberg, 1968). В большинстве случаев метод Ерне предпочтительнее, так как он проще и надежнее. Однако его недостаток состоит в большей продолжительности времени инкубации и в том, что с его помощью удается обнару-. жить только около половины антителосекретирующих клеток, выявляемых методом Каннингема. Оба метода в том виде, в котором они были описаны, позволяют обнаруживать клетки, синтезирующие ревматоидные факторы только IgM-класса.
А. Метод Ерне
Все растворы и клеточные суспензии готовят на СР с добавлением глюкозы (СР-Г, Mishell, Dutton, 1976). Агаровый раствор готовят, растворяя 1 г агара (Difco) в 100 мл кипящего СР-Г, и охлаждают до 45 °С в бане с постоянной температурой. .Добавляют 1,5 мл раствора ДЭАЭ-декстрана (Pharmacia) в концентрации 50 мкг/мл. В течение дальнейшей работы поддерживают температуру на уровне 45 °С и добавляют в следующей последовательности:
25 мкл 33%-ного (по объему) арс-ЪЭ
50 мкл суспензии антителосекретирующих клеток
25 мкл комплемента морской свинки
500 мкл 1%-ного агара, 0,75 мкг/мл ДЭАЭ-декстрана,
45 °С
Раствор быстро перемешивают и добавляют 20 мкл IgG-антител к гаптену (0,3—3 мг/мл). После добавления антител раствор опять быстро перемешивают, наслаивают на поверхность стандартной полистереновой чашки Петри (диаметр 85 мм) и инкубируют при 37 °С 6 ч. Зоны гемолиза подсчитывают, используя стандартный счетчик бактериальных колоний.
Б. Метод Каннингема
Предметные стекла с лунками и расплавленный воск подготавливают, как описано в работе (Cunningham, Szenberg, 1968). Компоненты смеси смешивают в следующей последовательно-• сти:
50 мкл 10%-ного раствора арс-ЪЭ 50 мкл суспензии антителосекретирующих клеток 50 мкл комплемента морской свинки, разбавленного в соотношении 1 :4
50 мкл IgG-анти-арс в концентрации 40—160 мкг/мл
Смесь заливают по 50 мкл в две инкубационные камеры, .герметизируют их расплавленным парафином, инкубируют 40—
Клетки, синтезирующие ревматоидный фактор
321
50 мин при 37 °С и сразу же подсчитывают зоны гемолиза под малым увеличением препаровального микроскопа.
Чувствительность обоих методов сильно зависит как от плотности гаптена на эритроцитах, так и от концентрации используемых антител к гаптену. Чтобы сделать чувствительность максимальной, следует провести тщательное титрование обоих компонентов, используя известные источники клеток, синтезирующих ревматоидный фактор.
IV. РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Твердофазный вариант радиоиммунологического и иммуно-ферментного анализа (ELISA) является мощным и чувствительным инструментом для определения ревматоидных факторов. Метод, который приводится ниже, представляет собой модификацию первоначально предложенных методов (Catt, Tregear, 1967; Klinman et al., 1976). Применение методов этого типа для определения ревматоидных факторов человека подробно описано Карсоном и др. (Carson et al., 1977). При разработке методов выявления РФ возникает ряд проблем, поскольку разделение иммуноглобулинов различных изотипов и приготовление антисыворотки к иммуноглобулинам или легким цепям данного изотипа связано с определенными трудностями. По возможности следует использовать соответствующие моноклональные антитела.
В табл. 19-1 в общих чертах обрисована основная стратегия применения радиоиммунологического анализа ревматоидных факторов. Как правило, на поверхности лунок пластиковых микропанелей адсорбируют иммуноглобулиновый аутоантиген, с которым связывается РФ. Избыток несвязавшегося антигена удаляют, а сайты сорбции белка на пластике блокируют. В лунки добавляют пробы, содержащие ревматоидные факторы, после соответствующего периода времени удаляют несвя-завшийся материал и лунки промывают. Для обнаружения связанного РФ используют меченые специфические антитела к антигенным детерминантам РФ (но не к иммуноглобулинам, адсорбированным на пластике). Можно также применять тест, основанный на конкуренции меченого РФ-стандарта с немеченым фактором, содержащимся в исследуемых пробах. Количественную оценку производят, сравнивая непосредственное связывание или подавление связывания известного количества РФ-стандарта с теми значениями, которые получают в присутствии экспериментальных образцов. Ниже детально описана методика радиоиммунологического теста, которую мы используем для выявления мышиного РФ, принадлежащего к IgM-классу и направленного против IgGl.
