Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 123

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 117 118 119 120 121 122 < 123 > 124 125 126 127 128 129 .. 239 >> Следующая

Методика. К 1 мл антител IgG-класса (1 мг/мл) в ЗФР добавляют 20 мкл 0,5 М дитиотрейтола и инкубируют 30 мин при 37 °С. Затем добавляют 50 мкл 0,3 М иодацетамида в 1 Мтрис-буфере, pH 8,0, инкубируют 20 мин при комнатной температуре и диализуют до полного уравновешивания с ЗФР.
B. Выбор гаптенной системы
Мы убедились на опыте, что эритроциты предпочтительнее конъюгировать с гидрофильным гаптеном п-азофениларсонатом (арс), чем с такими гидрофобными гаптенами, как динитрофенол. тринитрофенол и нитроиодофенол, по той простой причине,
Клетки, синтезирующие ревматоидный фактор
317
что В-клетки, специфичные к последним гаптенам, встречаются значительно чаще, чем В-клетки, специфичные к арс (приблизительно, 10“3 против 10~5). Это соображение очень важно» если в гемолитическом тесте предполагают использовать пробы* содержащие смесь антител различной специфичности. То же самое относится к использованию гетерогенных смесей антитело-секретирующих клеток в тесте определения зон гемолиза. Главным фактором, определяющим чувствительность теста на ревматоидный фактор, является фоновый лизис гаптенизированных эритроцитов в отсутствие антител-мишеней. В том случае, когда приходится все же использовать гидрофобные гаптены, мы рекомендуем работать с относительно слабогаптенизированными клетками, чтобы уменьшить фоновый уровень, обусловленный низкоаффинными антителами к гаптену.
Г. Конъюгирование арсоната с эритроцитами
Бараньи эритроциты (БЭ) трижды промывают в ЗФР — 1%-ной декстрозе и суспендируют их в ЗФР — 2%-ном борате (1:1 по объему), pH 8,2. Диазониевую соль арс готовят следующим образом: растворяют 60 мг арсаниловой кислоты в 0,7 мл охлажденной 1 н. НС1 и 20 мг NaN03 в 2,1 мл охлажденной воды; оба раствора смешивают и проводят реакцию во льду в течение 10 мин. В отдельной пробирке во льду смешивают 10,5 мл ЗФР — 2%-ного бората, pH 8,2 и 0,7 мл 1 н. NaOH. Объединяют эту смесь борат — NaOH с раствором диазониевой соли арс для получения забуференного изотонического раствора, содержащего 20 мМ диазониевой соли. Немедленно смешивают равные объемы диазониевой соли и суспензии БЭ и инкубируют смесь во льду 1 ч. Трижды промывают клетки в ЗФР—1%-ной декстрозе. Конъюгированные клетки в ЗФР — 1%-ной декстрозе можно хранить при 4 °С до 1 нед.
Д. Приготовление комплемента
Комплемент морской свинки (Gibco, Colorado Serum Company) адсорбируют равным объемом осадка конъюгированных эритроцитов в течение 1 ч во льду. Затем клетки осаждают центрифугированием при 2000 g в течение 10 мин при 4°С. Абсорбированную сыворотку хранят в аликвотах при —20 °С.
Е. Гемолитический тест для скрининга гибридом
Пробы надосадочной жидкости из культур объемом 30— 35 мкл или пробы, разбавленные культуральной средой либо' ЗФР Дульбекко, помещают в V-образные лунки стандартных
318 Глава 19
микропанелей. В каждую лунку добавляют 50 мкл раствора, содержащего 0,3% (по объему) гаптенизированных ЭБ, 1 мкг/мл антител к гаптену (интактных или восстановленных и алкилиро-ванных в мягких условиях) и 10% адсорбированного комплемента морской свинки, растворенного в ЗФР Дульбекко. Это можно сделать с помощью калиброванной капельницы (Dyna-tech, номер по каталогу М17). При 30-минутной инкубации смеси при 37 °С отрицательным и положительным контролем служат лунки, в которые вносят: 1) суспензию гаптенизированных БЭ, не содержащую антител к гаптену, 2) свежую культуральную среду вместо надосадочной жидкости культуры и 3) ту же смесь, что и в опыте, содержащую, кроме того, 1% тритона Х-100. Лунки просматривают невооруженным глазом или с помощью препаровального микроскопа при семикратном увеличении.
Ж. Количественный гемолитический тест
В эппендорфовских пробирках на 1,5 мл смешивают;
1) 50 мкл тестируемой пробы, которую иногда разбавляют ЗФР Дульбекко, содержащим 10 мг/мл БСА; 2) 50 мкл 1%-ной суспензии гаптенизированных ЭБ, содержащей или не содержащей 6 мкг/мл очищенных антител к гаптену; 3) 200 мкл комплемента морской свинки, разбавленного 1 :25 ЗФР Дульбекко. Инкубируют 30 мин при 37 °С. Добавляют 700 мкл ЗФР Дульбекко и центрифугируют при 2000 g 10 мин. Неразрушенные клетки (осадок) отбрасывают, а в надосадочкой жидкости измеряют оптическую плотность при 414 нм.
Контроль. В пробу контроля 100%-кого лизиса вместо антител добавляют тритон Х-100 (1%) в ЗФР Дульбекко (или среде); в пробу контроля на отсутствие лизиса (0% лизиса) вместо антител добавляют ЗФР Дульбекко или среду, содержащую 10 мг/мл БСА. Процент лизиса рассчитывают по следующей формуле:
Патент лизиса = 100-А*14 (эксперимент) ~ А*»«(0% л-иса) -процент лизиса iuu (Ю0% лизиса) _Аш (0% лизиса) *
На рис. 19-1 показана относительная эффективность теста при определении ревматоидных факторов IgM- и IgG-классов. Форма кривых свидетельствует о том, что в то время как лизис эритроцитов способна вызывать одна молекула IgM-РФ, для лизиса, опосредованного IgG-РФ, необходимо, чтобы к мембране в тесном соседстве друг с другом присоединились по крайней мере две его молекулы. Ревматоидный фактор IgG-класса будет подчиняться одноударной кривой титрования, если добавить специально приготовленную проявляющую антисыворотку, свя-
Предыдущая << 1 .. 117 118 119 120 121 122 < 123 > 124 125 126 127 128 129 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed