Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
314 Глава 18
секреции антител, нельзя ожидать, что ИЛ-3 может заменить вспомогательные клетки и все другие факторы, требующиеся для дифференцировки.
Чтобы определить оптимальные концентрации WEHI-SUP или ИЛ-3, необходимые для получения линий предшественников В-клеток, следует иметь постоянно ведущуюся линию предшественников, зависимых от ИЛ-3. Такие линии могут быть получены по запросу исследователей.
Литература
Broxmeyer Н. Е., Juliano L., Lu L. et al. (1984). J. Clin. Invest., 73, 939— 953
Garland J., Lanotte М., Dexter М. T. (1982). Eur. J. Immunol., 12, 332—336. Gery I., Gershon R., Waksman В. H. (1972). J. Exp. Med., 136, 143—147.
Gillis S., Mizel S. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 1133—1137.
GiUis S., Ferm М., Ou W., Smith D. A. (1978). J. Immunol., 120, 2027—2033. Greenberger J. et al. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 2931—2935. Howard M. et al. (1982). J. Exp. Med., 155, 914—920.
Ihle J. N. et al. (1982a). J. Immunol., 129, 2431—2436.
Ihle J. N.. Rebar L„ Keller J. et al. (1982b). Immunol. Rev., 63, 5—50. Larsson E., Iscove N., Coutinho A. (1980). Nature (London), 283, 664—666. Leanderson T. et al. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 7455—7459. Lernhardt W., Corby C., Wall R., Melchers F. (1982). Nature (London), 300,
355.__357
Palacios R., Garland J. (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 1206—1212. Palacios R., Henson G., Steinmetz М., McKearn J. P. (1984a). Nature (London), 309, 126—134.
Palacios R. et al. (1984b). Submitted.
Withlock C. A., Witte O. N. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 3608— 3612.
Yokota T. et al. (1984). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 1070—1074.
Глава 19
Методы определения клеток, синтезирующих ревматоидный фактор
Дэвид А. Нимэйзи
I. ВВЕДЕНИЕ
Существует много различных методов для определения аутоантител, связывающихся с константной частью иммуноглобулинов. Первыми из них были описаны гемагглютинационные тесты, в которых для определения сывороточных ревматоидных антител использовали эритроциты, сенсибилизированные субагглютинирующими количествами антиэритроцитарных антител (Waaler, 1940; Rose et al., 1948). С их помощью была установлена связь между ревматоидным артритом и агглютинирующими факторами такого рода, что и привело к появлению термина «ревматоидный фактор». Различные модификации этого основного теста, первоначально известного как тест Роуза —Ваа-лера, и сейчас используются для обнаружения ревматоидного фактора в сыворотках крови человека.
Описываемые ниже методики более чувствительны, чем гем-агглютинация. Кроме того, метод определения зон гемолиза позволяет обнаруживать индивидуальные антителосекретирующие клетки. Используемые в настоящее время методы особенно удобны для определения ревматоидных антител, синтезируемых либо клеточными линиями, гибридомами и нормальными клетками, индуцированными митогенами in vitro, либо клетками, свежевыделенными из организма.
II. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗОН ГЕМОЛИЗА
В основе этого метода лежит наиболее старая форма имму-ноферментного анализа — комплемент-зависимый лизис эритроцитов. Эритроциты-мишени сенсибилизируются иммуноглобулином в такой форме, которая не связывает комплемент. Пробы, которые содержат ревматоидный фактор, связывающийся с сенсибилизированными клетками, могут быть обнаружены по лизису эритроцитов в присутствии комплемента. Этот тест наиболее чувствителен к ревматоидным факторам IgM-класса, но с помощью соответствующих модификаций (они будут обсуждаться ниже) можно увеличить его чувствительность и по. отношению
316 Глава 19
к ревматоидным факторам IgG-класса. Метод, который мы опишем, был успешно использован для скрининга супернатантов мышиных гибридов на активность ревматоидного фактора IgM-класса (IgM-РФ). Это наиболее быстрый из всех описанных методов такого рода; он включает относительно небольшое число манипуляций и всего лишь 30-минутную инкубацию.
A. Антитела-мишени
В качестве иммуноглобулина, с которым связывается ревматоидный фактор, мы используем моноклональные антитела, специфичные по отношению к определенному гаптену. Это позволяет антителам-мишеням нековалентно связываться с эритроцитами, конъюгированными с гаптеном. Такой подход имеет два главных преимущества по сравнению с химической конъюгацией иммуноглобулина с эритроцитами. Во-первых, он дает возможность, работая с одним и тем же препаратом эритроцитов, использовать серию различных антител к одному гаптену, различающихся по классу тяжелых цепей. Это позволяет анализировать изо- и аллотипическую специфичность ревматоидных факторов. Во-вторых, предлагаемый метод исключает возможность прямых химических модификаций антигена-мишени, которые могут возникать при ковалентных сшивках антител и эритроцитов.
Б. Восстановление и алкилирование антител-мишеней
За исключением тех случаев, когда антитела-мишени не являются комплемент-связывающими, их необходимо восстанавливать и алкилировать в мягких условиях, чтобы предотвратить непосредственный лизис клеток-мишеней. При этом связывание антителами ревматоидных факторов, по-видимому, не меняется (Zvaifler, Schur, 1968; Tanimoto et al., 1975; Nemazee, Sato, 1983).
