Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
А. Удаление прикрепляющихся клеток
Прикрепляющиеся клетки плейоморфного типа могут быть-отделены от остальных пропусканием суспензии клеток через-колонки с нейлоновой ватой. В результате хорошего разделения обычно получают стартовую клеточную популяцию, сходную с теми, которые изображены на рис. 18-1, Д и Е. Небольшое число оставшихся, несмотря на очистку, прикрепляющихся клеток погибает в течение первых 10 сут культивирования. Однако если клетки прикрепляющегося типа начинают интенсивно* размножаться, то рекомендуется перенести неприкрепляющиес» клетки в новые лунки. Это делают, осторожно отсасывая не-
20*
Рис. 18-1. ИЛ-3 способствует размножению клеток миелоидного происхождения, которые подавляют рост ИЛ-З-зависимых предшественников В-клеток (Л—Д). Детали указаны в тексте.
Рис. 18-1. (Продолжение.)
310 Глава 18
прикрепившиеся клетки пастеровской пипеткой без ресуспендирования всей культуры. Хотя нам удалось получить линии предшественников В-клеток, используя либо КС-A, либо КС-Б, содержащие WEHI-SUP (WEHI-KC), мы обнаружили, что среда RPMI 1640, содержащая СКЧ группы АВ, глутамин и антибиотики (КС-Б), лучше подходит для этих целей, и поэтому предпочтительнее использовать именно эту среду.
Б. Размножение клеток
Клетки, приготовленные так, как было детально описано выше (5—10-103), суспендируют в 0,5 мл WEHI-KC и инкубируют в лунках панелей Limbro при 37 °С. Каждые 3 сут половину объема среды заменяют свежей, поддерживая в лунке постоянный объем 0,5 мл. Эту процедуру повторяют трижды и затем переносят клетки в культуральные флаконы. Важно избегать чрезмерного разбавления культуры и следить за тем, чтобы клетки переносили в новые лунки только после того, как культуры достигнут конфлюентности. Попытки перенести клетки из панелей Limbro в культуральные флаконы на более ранних стадиях часто приводят к потере клеточной линии. Клеточную линию считают стабильной, если перенос и разрежение культуры через каждые 3-—4 сут не останавливают размножения клеток. Полученные клеточные линии собирают каждые 3—4 сут и разбавляют в отношении от 1:6 до 1:10 свежей WEHI-KC.
Используя те же клетки, можно начинать культивирование с клонирования одиночных клеток или проводить анализ методом лимитирующего разведения. В ряде случаев популяцию предшественников В-клеток обогащают или даже выделяют их в чистом виде с помощью положительной селекции, применяя моноклональные антитела к антигенам В-220, АА4.1 или GF1.2. При этом используют методики адсорбции на чашках (пен-нинг), образования розеток или применяют флуоресцентный клеточный сортер. Одиночные клетки можно поместить с помощью микроманипуляций в круглодонные лунки микропанелей и культивировать их в 200 мкл WEHI-KC или в присутствии очищенного ИЛ-3. При этом среду меняют каждые 3 сут и положительные культуры размножают в лунках панелей Limbro и во флаконах для тканевых культур.
В. Подавление миелоидного и эритроидного ростков
Еще один практический аспект, который полезно обсудить, состоит в том, что размножающиеся без дополнительной стимуляции гистиоциты человека линии U-937 выделяют в культуральную среду некий фактор, препятствующий росту мнелоид-ных клеток, но не влияющий на пролиферацию ИЛ-З-зависимых
Условия для получения линий пре-В-клеток
311
предшественников В-клеток. Этот фактор не является ИЛ-1, который также присутствует в этих препаратах. Известно, что дифференцировку и размножение клеток миелоидного и эритро-идного ростков подавляют кислые изоферритины, в норме сек-ретируемые макрофагами (Broxmeyer et al., 1984). Предварительные результаты свидетельствуют о том, что клетки U-937 секретируют кислые изоферритины. Вероятно, супрессорное действие надосадочной жидкости культур U-937 на рост миело-идных клеток определяется именно этими веществами. Когда исходные популяции содержат небольшое, но все же достаточное число миелоидных клеток (рис. 18-1, Г и Д), добавление надосадочной жидкости U-937 благоприятствует получению ИЛ-З-зависимых линий предшественников В-клеток, но она вовсе не обязательна для их роста.
Аликвоты клеточных суспензий можно замораживать (см. ниже) и проверять на зависимость от экзогенных факторов роста, инкубируя их в КС-A или КС-Б при 37 °С. В отсутствие ИЛ-3 клетки, зависимые от этого фактора роста, погибают в течение 24—36 ч (они просто распадаются!). Для того чтобы предотвратить заражение культур, в особенности микоплазмой, мы регулярно принимаем следующие меры предосторожности.
1. Через каждые 3—4 мес гентамицин в культуральной среде временно, на 1 мес, заменяют на тилозин и линкомицин. В связи с этим при культивировании в среду добавляют только гентамицин.
2. Каждые 10 мес гентамицин заменяют на солянокислый хлортетрациклин, для того чтобы предотвратить появление в лаборатории вариантов бактерий, устойчивых к гентамицину. Через 2 мес хлортетрациклин вновь заменяют на гентамицин.
Г. Замораживание клеточных линий
Полученные клеточные линии можно замораживать, используя стандартные методики. Осажденные клетки (107) ресуспендируют в 1 мл среды RPMI 1640, содержащей 20% СПК, глутамин, гентамицин и 10% ДМСО, после чего выдерживают суспензию при —70 °С в течение ночи, а затем переносят в жидкий азот. После размораживания клетки один раз промывают в КС-Б и переносят в WEHI-KC (2-105 клеток/мл). Обычно размножение клеток обнаруживают через 3—4 сут.
