Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
U-937 SUP 197 203 208 210 200 207
EL-4 SUP 28 324 20 437 11015 5428 3216 1825
Активность ИЛ-1, имп/мин2>
[надосадочную жидкость добавляли к клеткам
LBRM-33 (клон1А5), обработанным ФГА]
Среда 218 235 241 215 224 212
WEHI-SUP 230 248 250 230 217 203
U-937 SUP 25 780 19 368 10 804 5377 2933 1021
') Пробы надосадочной жидкости тестировали на способность усиливать рост ИЛ-З-зависимых клеток ЕаЗ или ИЛ-2-зависимой линии CTLL. Интенсивность размножения клеток измеряли по включению 3Н-тимидина в течение последних б ч 24-часового-культивирования при 37 °С.
2) Пробы надосадочной жидкости инкубировали с клетками LBRM-33 (клон 1А5; 5 - Юч клеток на лунку) в присутствии ФГА при 37 °С 36 ч. Пробы собирали, облучали дозой 8000 рад и тестировали на присутствие активности ИЛ-2, используя клетки линии CTLL (2-10* клеток на лунку).
1972), или на Т-клеточной лимфоме LBRM-33. В последнем случае тестирование основано на способности этой лимфомы усиливать секрецию ИЛ-2 в присутствии ИЛ-1 и фитогемагглюти-нина (Gillis, Mizel, 1981). В табл. 18-1 представлены результаты опыта, иллюстрирующего тестирование одной из партий WEHI-SUP на активность ИЛ-3, ИЛ-2 и ИЛ-1. Нам ни разу не-удалось обнаружить партию WEHI-SUP, содержащую активность ИЛ-2. Ларссон и др. (Larsson et al., 1980) нашли, что-клетки WEHI-3 вырабатывают ИЛ-1. Мы не смогли подтвердить эти наблюдения, даже используя клетки этой линии из-того же источника, что и упомянутые авторы (табл. 18-1).
Оптимальной концентрацией WEHI-SUP мы считали предпоследнее из трех разведений этой надосадочной жидкости, при!
?0—1278
306 Глава 18
котором проявлялась активность ИЛ-3. Например, данные, приведенные в табл. 18-1, указывают на то, что тестируемая WEHI-SUP активна вплоть до разведения 1:64. Следовательно, эту партию надосадочной жидкости следует использовать при разведении 1:32.
V. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КЛЕТОК
А. Клетки костного мозга
Мышей забивают смещением шейных позвонков и немедленно споласкивают в 70%-ном этаноле. С помощью микрохирургических ножниц удаляют кожу с передней поверхности бедра, вырезают бедренную мышцу и удаляют бедренную кость, делая разрезы шовными ножницами Лилтаура непосредственно под ее сочленением с тазом и ниже коленного сустава. Бедренную кость помещают в холодную КС-A или КС-Б в чашки Петри и до забора костного мозга хранят во льду. Для забора костного мозга бедренную кость прежде всего переносят во вторую чашку Петри, содержащую холодную среду, и споласкивают ее. Кость крепко зажимают стерильным пинцетом посредине и осторожно удаляют скальпелем коленный сустав. Костномозговую пробку вымывают 1,5—2 мл среды, используя шприц на 2—5 мл и иглу № 25. Для того чтобы костный мозг вымыть полностью, внутреннюю поверхность кости скоблят иглой. Клетки собирают в стерильные пробирки, центрифугируют (200 g, 10 мин), промывают СР и ресуспендируют в концентрации 108 жизнеспособных ядерных клеток на 5 мл среды RPMI 1640, содержащей 20% СПК.
Б. Клетки селезенки
Удаление селезенок и приготовление клеточных суспензий проводят в стерильных условиях. Эритроциты лизируют в буфере трис-НС1-аммоний, а оставшиеся интактными клетки дважды промывают СР и ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 5% СПК. Клетки промывают два раза СР и жизнеспособные клетки (Ю8) ресуспендируют в 5 мл среды RPMI 1640, содержащей 20% СПК.
Клетки костного мозга или селезенки, полученные, как описано выше, пропускают через колонки с нейлоновой ватой. Колонки промывают 50 мл СР и затем 15 мл среды RPMI 1640, содержащей 20% СПК. Промытые колонки, содержащие по 7 мл среды RPMI 1640 с 20% СПК, инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Дают возможность вытечь всей жидкости из колонки, после чего закрывают выходной зажим. На колонку на-
Условия для получения линий пре-В-клеток 307
^---------------------------------------
носят 108 клеток костного мозга или селезенки, суспендированных в 5 мл RPMI + 20% СПК. Зажим открывают, а когда клетки «заполнят» колонку, его вновь закрывают. Затем наносят на колонку 1 мл среды RPMI, содержащей 20% СПК, накрывают колонку крышкой и оставляют ее при 37 °С на 45 мин. Не связавшиеся с ватой клетки собирают в стерильные пробирки, промывая колонку 15—20 мл предварительно подогретой среды со скоростью 1 капля/с и затем СР. Клетки, элюированные с нейлоновой ваты, обрабатывают антителами к антигенам Thy-1 и 1а в присутствии комплемента, трижды промывают в КС-А и ресуспендируют до желаемых концентраций в культуральной среде WEHI-KC.
VI. ПОЛУЧЕНИЕ ИЛ-З-ЗАВИСИМЫХ ЛИНИИ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ В-КЛЕТОК
Наиболее важным условием получения ИЛ-З-зависимых линий предшественников В-клеток является как можно более полное удаление клеток миелоидного происхождения. Известно, что ИЛ-3 способствует пролиферации миелоидных клеток (Green-berger et al., 1983; Garland et al., 1982), а по нашим наблюдениям эти клетки подавляют размножение ИЛ-З-завнсимых В-клеточных предшественников. Этот феномен четко прослеживается на серии фотографий, представленных на рис. 18-1. Клетки, препятствующие росту ИЛ-З-зависимых В-клеточных пред-шественников, представляют собой прикрепившиеся к подложке большие плейоморфные клетки, часть из которых содержит гранулы (рис. 18-1,.Л и Б). Как показано на рисунке, в культурах, состоящих в основном из прикрепившихся плейоморфных клеток (рис. 18-1, Л), отсутствуют круглые, неприкрепляющие-ся клетки небольшого и среднего размера. Если число прикрепившихся клеток уменьшается, то число круглых неприкрепив-шихся клеток (среди которых присутствуют предшественники В-клеток) увеличивается (рис. 18-1, ?—Д).
