Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
3. Селекция гибридов
Через двое суток после гибридизации в каждую лунку добавляют по 100 мкл селективной среды. Селективной средой служит CS-среда, содержащая гипоксантин (10-4 М), аминоп-•герин (4-10-7 М), тимидин (1,6-Ю-5 М) и уабаин (1-10~3 М). Для предотвращения цитостатического эффекта тимидина добавляют дезоксицитидин до конечной концентрации 2-Ю-5 М (Conzelmann et al., 1982b). Однако эта предосторожность, по-видимому, необязательна, поскольку все наши гибриды были получены в отсутствие этого вещества. Через 4—5 дней после слияния по 150 мкл среды из каждой лунки заменяют на свежую селективную среду. Обычно в некоторых лунках обнаруживают размножение клеток через 10 сут после слияния, но иногда это происходило позже: только через 30 сут. При засеве по 3,6-Ю4 слившихся клеток на лунку размножение, как правило, получают в 10—40% культур. Клетки конфлюентно-го монослоя отделяют от подложки с помощью среды, не содержащей Са2+ и Mg2+ (разд. III, Д, 4), и переносят в большие по размеру лунки 24-луночных панелей (Costar 3524), которые содержат CS-среду с гипоксантином (10-4 М) и тимидином (1,6-Ю-5 М), но без аминоптерина, чтобы свести к минимуму остаточный токсический эффект последнего. Через 3—4 сут клетки конфлюентного монослоя отделяют от подложки и переносят в небольшие пластиковые флаконы на 10 мл в CS-среде без селективных агентов.
Цитолитические Т-клеточные клоны и гибридомы
289
4. Выделение цитолитических клонов
Фактически все культуры, полученные при слиянии клонов ЦТЛ третьего типа (разд. IV, Б, 2) с клетками BW5147, обладают специфической цитолитической активностью, однако у большинства гибридов эта активность была ниже, чем цитоли-тическая активность родительского клона ЦТЛ.
Культуры, обладающие высокой специфической цитолитической активностью, клонируют в CS-среде. В каждую лунку панелей для микротитрования вносят в среднем одну гибридную клетку и 2-104 облученных рентгеном (2000 Р) перитонеальных клеток в 200 мкл CS-среды. -Перитонеальные клетки получают промыванием СР брюшной полости сингенных или аллогенных мышей. По достижении конфлюентности клоны переносят в лунку Costar 3524, наращивают клетки в CS-среде и проверяют их на цитолитическую активность. Клоны, обладающие высокой цитолитической активностью, культивируют в CS-среде и обычно повторно клонируют несколько раз, для того чтобы отобрать клоны со стабильной экспрессией цитолитической активности. Повторное клонирование обычно проводят в CS-среде без каких-либо фидерных (питающих) клеток.
5. Идентификация гибридов
Клетки, которые растут в селективной среде, скорее всего являются гибридами, так как негибридизованные родительские клетки в этой среде не размножаются. Отличать гибриды от родительских клеток позволяют следующие наблюдения.
1. Среди клеток, подвергшихся слиянию, регулярно возникают С5~-варианты (разд. IV, В, 1). Мы никогда не получали CS'-вариантов из клонов ЦТЛ третьего типа, хотя один такой клон описан в литературе (Benjamin et al., 1982).
2. Гибридные клоны обычно растут несколько быстрее и достигают более высокой клеточной плотности (до 2-10® клеток/мл), чем культуры клонов ЦТЛ.
3. Содержание ДНК в гибридах выше, чем в каждом из родительских типов клеток. Содержание клеточной ДНК определяли по методу Тейлора и Милторпа (Taylor, Milthorpe,
1980), используя связывающийся с ДНК краситель иодистый пропидий и флуоресцентный клеточный сортер.
4. Гибридные клетки имеют большее число хромосом, чем клетки каждой из родительских линий по отдельности, но обычно меньше, чем сумма хромосом обеих родительских линий.
5. Гибриды экспрессируют маркеры, характерные как для одной, так и для другой родительской линии. Тимома BW5147
19—1278
290 Глава 17
возникла из клеток мышей AKR, экспрессирующих антиген Thy-1.1. Поскольку большинство других линий мышей экспрессирует антиген Thy-1.2, гибриды можно идентифицировать серологическими методами. Во многих случаях гибриды идентифицируют с помощью антисывороток к антигенам МНС. Альтернативные методы идентификации гибридных клеток детально описаны ранее (Ruddle, 1982; Beezley, Ruddle, 1982).
Е. Функциональные тесты
1. Определение пролиферации
Пролиферативный ответ на антиген измеряли, культивируя совместно Т-клетки (5-104) и облученные рентгеном клетки-стимуляторы (106) из селезенки (в некоторых случаях из этой популяции удаляли Т-клетки) в 0,2 мл среды в плоскодонных лунках панелей для микротитрования в присутствии экзогенного ФРТК или без него. Через 48 ч культивирования в каждую лунку добавляли по 2 мкКи 3Н-тимидина и через 72 ч определяли включение метки в ДНК на сцинтилляционном счетчике.
2. Определение цитолитических Т-клеток
ЦТЛ суспендировали в 2 мл культуральной среды и делали ряд последовательных разведений суспензии. Клетки-мишени, меченные 51Сг, суспендировали в культуральной среде в концентрации 2-105 клеток/мл. В качестве мишеней использовали либо опухолевые клетки, либо клетки селезенки, стимулированные культивированием в течение 48 ч в присутствии ЛПС (100 мкг/мл). В каждую круглодонную лунку панелей для микротитрования (Greiner, N'urtingen, ФРГ, номер по каталогу 220-24-AR) помещали по 100 мкл суспензии тестируемых Т-лимфоцитов и 100 мкл суспензии, содержащей 2-104клеток-мишеней. Для определения спонтанного выделения метки из клеток в некоторые лунки вносили только клетки-мишени (2-104 в 200 мкл). Панели центрифугировали при низкой скорости (24 g) 5 мин и инкубировали 3 ч при 37 °С в атмосфере, насыщенной водяным паром и содержащей 10% СОг. Для анализа каждой популяции ЦТЛ использовали два параллельных набора проб. После завершения инкубации с помощью шести-канального микрошприца (Hamilton, Whittier, США) по 100 мкл супернатанта из каждой лунки переносили в маленькие пластиковые пробирки и измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике (Pohlit et al., 1979).
