Феромоны насекомых - Лебедева К.В.
Скачать (прямая ссылка):
Техника использования ГЖХ-ЭАГ сводится к тому, что в газовый хроматограф, снабженный сплиттером, вводится экстракт феромона, или активная фракция; выходящие из хроматографа компоненты собираются с интервалом 1—2 мин, а затем биотестируются ЭАГ [16, 35, 40—43, 84, 158, 159, 252, 253]. Если хроматограф сочленен непосредственно с биодетектором, то биотестирование происходит на выходе из газового хроматографа [12, 26, 54, 104, 254]. Компоненты, дающие максимальный ЭАГ-сигнал, считаются потенциальными компонентами феромона. Параллельно на антенне интересующего вида насекомого проверяется серия ненасыщенных ацетатов, альдегидов, спиртов, с разным положением двойных связей и с разной их геометрической конфигурацией. Если в исследуемом соединении две двойные связи, то максимальный сигнал будет и на мононенасыщенные соединения с двойными связями в положениях, соответствующих таковым в двуненасыщенном соединении [10, 16, 17, 20, 54, 55, 110, 146, 151, 159, 168, 255].
Преимущество метода ГЖХ-ЭАГ состоит в том, что он нуждается в ограниченном количестве особей для экстракции (50-200 самок) , а потому неоценим при идентификации минорных количеств веществ, которые могут быть невидимы на хроматограмме, но давать сигнал ЭАГ, так как чувствительность антенны насекомого на много порядков выше чувсти-тельности хроматографа с ПИД. В этом случае по времени удерживания активного, но невидимого на хроматограмме компонента можно судить о его структуре [26, 109, 123, 128, 154].
Преимущество биотестирования с помощью ЭАГ перед поведенческим или даже полевым биотестом в том, что минорные компоненты, которые сами по себе могут быть и неактивными, всегда дают сигнал и не могут быть пропущены при выделении из природного материала. Кроме того, эти компоненты по своей природе могут оказаться родственными основ-
40
ному компоненту феромона, а потому, сравнивая их времена удерживания с временами удерживания эталонов, можно сделать предварительное заключение об их структуре. По размерам пиков на хроматограмме природного экстракта возможно установить соотношение компонентов, приближающееся к природному, составить смесь из идентифицированных таким образом компонентов и проверить ее в поле. Метод ГЖХ—ЭАГ позволил установить структуру феромонов многих видов чешуекрылых. Геометрическая конфигурация компонентов в этом методе определяется сравнением с активностью и временами удерживания синтетических Z- и Е-изомеров.
Идентификация одно-, двухминутных фракций ГЖХ
При препаративном сборе одно-, двухминутных фракций ГЖХ используются препаративные колонки разной полярности и охлаждаемые капилляры для сбора фракций. ЭАГ-сигнал измеряют в милливольтах (мВ).
Для препаративного выделения феромона P.unipuncta из сырого экстракта кончиков брюшка упарили хлористый метилен и добавили гептан. Геп-тановый раствор ввели в газовый хроматограф со сплиттером 1:10. Феромон собирали в стеклянные ловушки, охлаждаемые сухим льдом в ацетоне, и анализировали ЭАГ. Образцы (100 мкг) биотестировали дважды и повторяли трижды в разное время, сравнивая с эталонами и на разных антеннах [146]. В таком эксперименте рекомендуется использовать не менее пяти различных антенн.
Два компонента феромона Scotia exclamationis (Z5TDA: Z9TDA= 95 : 5) были идентифицированы методом ГЖХ-ЭАГ на четырех колонках: 10% Silar ЮС, 5% Апиезон L, 10% Ucon LB 550Х и стальной колонке WCOT с DEGS [257]. Аналогично, с использованием полярных и неполярных колонок в сочетании с ЭАГ найдены феромоны Spodoptera exempta [160], S. frugiperda [5], A. transitella [130], Aegeria tibialis [192], A. lineatella [105], A. podana, A. citrana [86], A. velutinana [28].
Этот метод с успехом был использован при идентификации феромона Dendrolimus spectabilis, оказавшегося смесью изомеров Z5E7DDDOL и E5E7DDDOL, второй случай после феромона В. mori, когда и основная и минорная компонента — спирты. ЭАГ-активность была обнаружена у спиртовой фракции гексанового экстракта кончиков брюшка самок этого вида (2 тыс. особей). Эта фракция была получена ТСХ на силикагеле (СГ). Препаративной ГЖХ на колонке с 1% OV-1 был выделен 5.7DDDOL. Его анализ на полярной колонке с 2% ПЭГ 20М подтвердил наличие в этой фракции двух изомеров - Z5E7DDDOL и E5E7DDDOL в соотношении 5 : 1. Хроматомасс-спектрометрией фракции от деления ТСХ на аргенти-рованной пластинке из силикагеля получено дополнительное доказательство того, что в экстракте самок этого вида содержатся именно эти изомеры [110, 217].
Анализ ГЖХ—ЭАГ экстракта желез 0,6 самки-эквивалента Ephestia cautella на колонке (1,83, м X 2 мм) с 2,5% Карбовакса 20М на Хромо-сорбе AW-DMCS при программировании температуры 120° — ->-40о/мин — -*• 220“ С с ПИД позволил обнаружить два основных компонента — Z9TDA (5 нг) и Z9E12TDDA (10 hi-) . Минорный компонент обнаружить этим методом не удалось, поэтому была использована техника трихлорацилиро-вания и анализа с ДЭЗ [ 153].
Для установления строения компонентов феромона О. furnacalis экстракт целых насекомых, частично очищенный колоночной хроматографией, анализировали ГЖХ-ЭАГ, используя колонку (2 м X 0,3 см) с 2% ПЭГ
