Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Тем же методом Массей, Харрингтон и Хартли [98] исследовали ферменты — химотрипсин и химотрипсиноген, обнаружив полимеризацию этих ферментов при увеличении концентрации, и определили число мономеров в полимере. Оказалось, что это число равно 4—8 для химотрипсина и 2 для химотрипсиногена, причем в последнем случае субъединицы соединяются «встык», образуя цепочку. В работе [99] изучение поляризации флуоресценции позволило выяснить влияние pH среды на взаимодействие акридинового оранжевого с ДНК.
Последовательное применение развитой Вебером теории вращательной деполяризации для молекул, которые можно апрокси-
мировать в виде эллипсоидов, позволяет решать не только та кие относительно простые задачи, но и более сложные, связанные с.определением формы макромолекул. Так, Вебер [89] показал, что молекулы овальбумина имеют форму, близкую к сферической, тогда как молекулы сывороточного альбумина представляют собой эллипсоиды с отношением осей 4:1.
В нашей работе [100] сочетанием флуорометрических и поляризационных измерений удалось показать, что для транспортной РНК как до, так и после гидролиза ее рибонуклеазой время вращательной релаксации 0 значительно больше, чем можно было р бы ожидать для сферической
частицы того же объема. При комнатной температуре, например, 0 = 4,4-10-8 сек для нативной РНК и 3,7-10~8 сек для гидролизованной, тогда как для
Рис. 42. Изменение степени поляризации ко-фермента глутаматаспартаттрансаминазы (пи-ридоксаля) (1) и скомплексированного с ферментом красителя изоцианата флуоресцеина (2) от концентрации фермента; 3 — то же, для рибонуклеазы, окрашенной тем же красителем
Рис. 43. Зависимость величины 0 для раствора акридинового оранжевого от концентрации добавленного аденина (1) или тимина (2) [97]
сферической частицы время 0 должно было бы быть равно 2,4-10-8 сек. Это расхождение указывает на значительную асимметрию молекулы тРНК- Сопоставление экспериментальных данных с расчетными (рис. 44) показало, что отношение осей для этих молекул имеет значения около 4,5: 1. Это позволило однозначно установить форму такой макромолекулы. В последнее время таким же путем удалось детально изучить вторичную структуру высокомолекулярной рибосомальной РНК [101].
Особенно перспективно применение этих методов в проблемах иммунохимии. Здесь уже давно применяется предложенный Кунсом [102] метод нанесения флуоресцирующей метки на антитела для изучения под микроскопом образования их комплексов
с антигенами. Однако применение уточненных методов, основан ных на изучении поляризации и длительности флуоресценции, может дать в этой области значительно более богатые и важные результаты. Как указывают Дэндликер и другие [103], эти методы, с одной стороны, могут стать средством для изучения термодинамики и кинетики реакции антиген — антитело, а с другой — могут оказаться полезными в решении ряда практических проблем, среди которых эти авторы отмечают: 1) обнаруже-
ние иммунологических событий в тех случаях, где отсутствие вторичных явлений делает классические методы неприменимыми (например, для вирусных агентов, гаптенов и непреципитирующих антител) ; 2) изучение гипер-сенситизации in vitro; 3) измерение тонких различий в действии антигенов на организм хозяина в случае хронических заболеваний; 4) исследование количества и качества антител на протяжении курса иммунизации организма.
В указанной работе имеется много ценных теоретических расчетов и интересных экспериментальных данных, но она представляет собой, конечно, только первый шаг в этом весьма перспективном направлении.
з. Длительное послесвечение растворов сложных органических молекул
Условия возникновения длительного .послесвечения. При обычных условиях, т. е. в растворах малой вязкости (вода, спирт) и при комнатной температуре, флуоресценция органических молекул характеризуется, как мы видели, весьма малыми значениями длительности возбужденного состояния, измеряющимися миллиардными долями секунды. Однако еще с конца прошлого века (Видеман, 1887) было известно, что при помещении исследуемого вещества в твердые стеклообразные среды (сахарные леденцы, расплавы борной кислоты и т. п.),
Рис. 44. Теоретические кривые зависимости отношения ----------? от То/0о, рас-
— 1 Ро 3
считанные по Веберу (сплошные линии), и экспериментальные данные (кружки и точки) для тРНК до и после обработки рибонуклеазой
а также при охлаждении растворов до низкой температуры наблюдается длительное послесвечение, которое в благоприятных случаях можно наблюдать в течение нескольких секунд после прекращения возбуждения *, хотя обычно длительность этого послесвечения меньше и не превышает долей секунды. Закон затухания этого свечения экспоненциальный, но константа его всегда на много порядков превышает значения т для обычной флуоресценции.
Особое внимание к этим явлениям было привлечено в 20-х годах нашего века после работ Вавилова, Левшина, Прингсгейма и др. Сейчас явления, связанные с наличием длительного послесвечения, стоят в центре внимания как физиков, изучающих явления люминесценции, так и биологов, старающихся выяснить роль возбужденных состояний ароматических соединений в важнейших процессах жизнедеятельности.
