Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Расчет показывает, что в общем случае степень поляризации определяется соотношением
Ы=(^-т)(,+т)- (®)
Для частиц сферической формы время релаксации
в = (66)
RT
где V—объем частицы (вместе с ее сольватационной оболочкой); т} — вязкость раствора; Т — его абсолютная температура; R — газовая постоянная. Подставляя это выражение в формулу (65), получаем известную формулу Перрена — Вавилова для степени поляризации сферических частиц
±_±=/JL_±Wi+-5LA (67)
Ро 3} \ V11
из которой следует, что величина — должна линеино зависеть от
Р Т \
отношения абсолютной температуры раствора к его вязкости ^—j .
Рис. 40 показывает, насколько хорошо оправдывается этот вывод в эксперименте.
1 т
Из наклона прямой на графиках, дающих зависимость — от —,
Р ч)
можно вычислить объем частицы, если ее можно считать сферической. Определения такого рода для молекул красителей хорошо совпали с другими данными.
При изучении макромолекул биополимеров уже нельзя всегда считать, что частица имеет сферическую форму. Напротив, во многих случаях мы имеем дело с частицами, резко асимметричными, палочкообразными. Апроксимируя такие частицы в виде эллипсоидов, Вебер [89] построил для них теорию вращательной деполяризации и показал, что с известным приближением формула (65) сохраняет силу и в этом случае, но время релаксации 0, которое мы будем обозначать через 0ЭЛ, представляет собой среднее гармоническое из трех главных времен релаксации, соответствующих вращению молекулы вокруг трех осей эллипсоида.
В частности, для эллипсоидов вращения
2 (68)
1/01 + 1/02
Рис. 40. Зависимость l/Р от T/ц для раствора флуорес-цеина в глицерине
Так как величины 0Х и 02 пропорциональны отношению ц/Т, то и
1
в этом случае должна сохраняться линеиная зависимость между —
Р
Т
и — , что также подтверждено экспериментом [89].
Л
Из формул Вебера можно вычислить для заданного отношения осей эллипсоида вращения (а/b) отношение времени релаксации 0ЭЛ к тому значению этой величины 0О, которое имела бы сферическая частица того же объема при данных условиях. Такая теоретически
Б
рассчитанная зависимость отношения — от — показана на рис. 41.
00 ^
Пользуясь этой кривой или рассчитанными, по Веберу, кривыми
1/Р — 1/з X и
зависимости отношения —--------— от — для разных значении а о,
l/А»-1/. 0о
можно, как будет^показано ниже, оценивать асимметрию макромолекул и устанавливать форму частиц биополимеров.
Примеры применения поляризационных измерений к проблемам молекулярной биологии. Из сказанного выше следует, что резких изменений в степени поляризации флуоресценции можно ожидать (.при постоянстве т)
14 -Физические методы исследования белков 209
тогда, когда существенно меняется либо объем молекулы, либо степень ее асимметрии. Первый случай имеет место при распаде макромолекулы на более мелкие части (субъединицы) или при образовании комплекса флуоресцирующей молекулы с другой молекулой.
В качестве примера можно указать на работу [96], в которой изучался распад молекулы фермента аспартатглутаматтрансами-назы (КФ:6.2.1.1) на две субъединицы при разбавлении водного раствора этого фермента. Резкое падение степени поляризации флуоресценции как самого фермен-' о та (точнее, его кофермента), так и
связанного с ферментом ковалентными связями красителя (изотиоцианата флуоресцеина) показывает, что при
2.5 2,0
1.5 1,0
I I I определенном разведении фермент
14 8 12 16 20 действительно распадается на две
a/L субъединицы (рис. 42, кривые 1, 2).
Рис. 41. Теоретическая за- В случае рибонуклеазы (кривая 3) та-
висимость отношения 0/0о от кое падение поляризации отсутствует,
что вполне естественно, так как рибо-нуклеаза — одноцепочечный, сравнительно низкомолекулярный белок. Интересно отметить, что каталитическая активность (сродство к субстрату) оказалось у субъединиц фермента значительно выше, чем у агрегированной (димерной) формы. Это позволяет думать, что, возможно, распад на субъединицы и агрегирование фермента есть один из механизмов регуляции его активности в клетке.
Пример возрастания поляризации флуоресценции при ком-плексообразовании можно найти в работе [97]. При добавлении к раствору красителя акридинового оранжевого возрастающих количеств аденина или аденозинтрифосфата поляризация флуоресценции красителя резко возрастает. Напротив, прй добавлении пиримидиновых оснований или нуклеотидов такое возрастание поляризации флуоресценции не имеет места (рис. 43). Это свидетельствует о том, что данный краситель комплексируется с пуриновыми основаниями и не комплексируется с пиримидиновыми.
