Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
^п
,= /-(- —-.' При повороте анализатора на 90* интенсивность естественной
компоненты не меняется, а поляризованная компонента вовсе не проходит через 1п
анализатор: /миннм = ^ • Таким образом, /р = /макс ^миним и ^р "Ь = ^макс + /миним- Подставляя эти выражения в формулу (62), получаем:
Р--
^макс ^миним
(63)
Если учесть, что поглощать свет могут частично и молекулы, расположенные под углом к вектору Е, то соответствующий
расчет показывает, что для случая, когда оси диполей поглощения и излучения совпадают, предельная поляризация флуоресценции р, т. е. та степень поляризации, которая имела бы место при полной жесткости среды и невозможности поворота молекулы в целом за время т, имела бы значение = 0,5.
Эго предельное значение степени поляризации зависит от угла а между осями осцилляторов поглощения и излучения. Если бы этот угол был равен 90°, то поляризация была бы отрицательна, т. е. в схеме рис. 37 направление колебаний света флуоресценции было бы параллельно оси х, т. е. перпендикулярно к направлению колебаний вектора Е возбуждающего света; при полной жесткости среды степень поляризации имела бы значение po = —4z-
Эти рассуждения показывают, что действительно излучение флуоресценции всегда должно быть в большей или меньшей мере поляризовано, причем степень поляризации может иметь любые значения, лежащие между + '/г и —*/з- Эксперимент полностью подтверждает этот вывод.
Заметим, что для простоты мы рассматривали случай возбуждения флуоресценции поляризованным светом. Это, однако, не обязательно. Флуоресценция будет частично линейно поляризована и при возбуждении естественным светом, хотя степень поляризации в этом случае будет меньше. Анизотропия излучающих молекул (диполей) создается теперь тем, что возбуждаются преимущественно молекулы, у которых оси осцилляторов поглощения образуют небольшой угол с плоскостью, перпендикулярной к направлению возбуждающего луча (плоскостью zy на рис. 37). Расчет показывает, что если обозначить через р значение степени поляризации флуоресценции при возбуждении поляризованным светом, а через рп ту же величину при возбуждении естественным светом, то при прочих равных условиях эти величины связаны соотношением
Практически это важно потому, что в случаях, когда интенсивность флуоресценции мала, а степень ее поляризации достаточно велика, можно вести измерения наблюдения при возбуждении естественным светом, т. е. более чем вдвое увеличить интенсивность возбуждения и флуоресценции.
Экспериментальные методы измерения степени поляризации флуоресценции. Не будем останавливаться на визуальных и фотографических методах измерения величины (поляриметры Корню, Савара и др.), потому что в настоящее время эти методы практически полностью вытеснены фотоэлектрическими методами и применяются чрезвычайно ред-
ко. Описание этих методов можно найги в книге П. П. Феофилб-ва [43] или в подробных классических курсах оптики.
Обычная схема опыта при измерениях поляризации соответствует рис. 37. Интенсивность флуоресценции измеряют фотоэлементом или фотоэлектронным умножителем, перед которым помещен анализатор (поляроид или поляризационная призма). Поворачивая этот анализатор вокруг оси пучка, определяют максимальное и минимальное значения силы фототока и вычисляют степень поляризации по формуле (63).
Этот простой статический метод достаточно точен, когда степень поляризации р велика, но для малых степеней поляризации он малопригоден. Легко видеть, что если разность /макс — /миним > входящая в числитель формулы (63), мала, то относительная ошибка в определении р будет значительно больше, чем относительная ошибка в измерении каждой из величин /макс и /мтим- Практически этот метод непригоден, если измеряемая величина р становится сравнимой
6/
с относительной погрешностью измерения
От этого недостатка свободен предложенный автором этой статьи [91] дифференциальный, или динамический, метод, заключающийся в том, что анализатор, находящийся перед фотоэлектрическим приемником света флуоресценции, равномерно вращают с некоторой постоянной частотой f. Простой расчет показывает, что при этом в фототоке имеются постоянная составляющая, пропорциональная /макс + /миним, и переменная, синусоидальная, составляющая частоты 2/, амплитуда которой пропорциональна /макс — Лишим- Таким образом, задача измерения степени поляризации излучения сводится к измерению отношения амплитуды переменной составляющей фототока к постоянной составляющей, т. е. к задаче измерения глубины модуляции фототока. Относительная погрешность измерения величины р при этом не зависит от значения этой величины.
В установке, описанной в работе [91], переменная составляющая тока компенсировалась поворотом стопы плоских пластинок, помещенной перед анализатором. В настоящее время в нашей лаборатории измеряют отдельно постоянную составляющую и амплитуду переменной составляющей фототока, которая усиливается резонансным усилителем и затем детектируется. Нетрудно и автоматизировать это измерение при помощи схемы, прямо измеряющей отношение двух токов или напряжений. Калибровочный множитель, на который необходимо умножить измеренное отношение двух токов для вычисления р, определяют, помещая перед анализатором поляризатор и определяя то отношение токов, которое соответствует значению /7 = 1,0.
