Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лазуркина Ю.С. -> "Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот" -> 82

Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.

Лазуркина Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот — Наука, 1967. — 343 c.
Скачать (прямая ссылка): fizmetodiisledovaniyabelkov1967.djvu
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 133 >> Следующая

Многие флуоресцирующие красители образуют прочные комплексы с белками и нуклеиновыми кислотами. Изучение люминесценции таких комплексов может быть источником ценной информации о вторичной структуре и молекулярной морфологии этих биополимеров. Для иллюстрации возможностей этих методов мы остановимся вкратце лишь на люминесцентном методе изучения
вторичной структуры нуклеиновых кислот, разработанном в на* шей лаборатории.
Детальное изучение всех характеристик люминесценции комплексов красителя акридина оранжевого (АО) с нативной двух-нитевой и (денатурированной) однонитевой ДНК [80] показало, что в первом случае, по крайней мере при не слишком высокой концентрации красителя, молекулы его, связанные с ДНК, сохраняют свою мономерную форму, тогда как при комплексировании с однотяжевыми структурами происходит в большей или меньшей мере димеризация этих молекул. Люминесценция мономеров
Рис. 34. Спектры флуоресценции комплексов акридинового оранжевого с нативной {А) и денатурированной (?) ДНК
СА0” 5- 10-“ Af; с ДНК =0’ 5, 10, 20, 40, мкг/мл для кривых 1, 2, 3, 4 соответственно. Кривые 4' и 4" — разложение спектра комплексов с денатурированной ДНК на мономерную и димериую составляющие [80]
и димеров, связанных с ДНК, существенно различается по всем своим основным характеристикам, которые отличны и от характеристик люминесценции свободных молекул в растворе.
Спектр люминесценции комплексов АО с нативной ДНК отличается от спектра люминесценции свободных молекул в водном (солевом) растворе лишь некоторым сужением полосы, обу-< словленным более крутым спаданием интенсивности в длинноволновой части спектра. Максимум спектральной полосы в обоих случаях лежит в зеленой части спектра — около 530 ммк (рис. 34, Л). Спектр флуоресценции связанных с ДНК димеров этого красителя сильно смещен в~красную сторону: максимум его лежит около 640 ммк (см. рис. 54, Б). Квантовый выход й длительность флуоресценции связанных мономеров примерно в 2,5 раза больше, чем для свободных мономеров в растворе: для свободных мономеров р= 0,35, х=2‘ 10~9 сек, для связанных мономе-
ров р = 0,9, т = 5'10-9 сек (флуоресценция димеров в растворе пренебрежимо слаба).
Когда мы наблюдаем флуоресценцию через зеленый светофильтр, пропускающий практически только излучение мономерных молекул АО (свободных и связанных), то вклад в наблюдаемое свечение будут давать молекулы двух различных сортов, каждый из которых характеризуется своим значением величин и т. При наблюдении через красный светофильтр основной вклад в люминесценцию дают связанные димеры, но в большей или меньшей степени будут давать вклад и мономеры. Таким образом, в этом случае мы имеем дело со смесью люминесцирующих образований трех различных типов. Во всех этих случаях понятие о средней длительности флуоресценции или средней длительности жизни возбужденных молекул теряет определенность и ясный физический смысл. Однако измеряемый на флуорометре сдвиг фазы ср между первичным модулированным потоком возбуждающего излучения и вторичным потоком люминесценции или величина
которую можно назвать «флуоромет-рическим т», представляет собой очень чувствительный индикатор на соотношение молекул различных типов в изучаемом объекте. Поскольку димеризация происходит, как было сказано, только на однотяжевых структурах, то эта величина является чувствительным индикатором на соотношение двухтяжевых и од-нотяжевых участков в исследуемой
О чувствительности этого индикатора дает представление рис. 35, изображающий в графической форме зависимость относительных значений изменения величины тКр (индексом «кр» отмечаются значения величины т, измеренные при наблюдениях через красный светофильтр) от процентного содержания денатурированной ДНК в смесях с нативной. Как видно из рис. 35, в благоприятных условиях этот метод позволяет обнаружить примесь денатурированной ДНК в количестве 1—3%.
Этот метод был применен прежде всего для определения сте-
t3,xk-W9 сек.
Рис. 35. Зависимость значений т для зеленой и красной области спектра, т3 (Л и тк (2—4) от содержания денатурированной ДНК в смеси с нативной
Общая концентрация ДНК 12 мкг/мл.
Кривые 2, 3, 4 сняты со светофильтрами КС-10, КС-13 и КС-17 соответственно
нуклеиновой кислоте [81].
пени спиральности транспортной (низкомолекулярной) РНК (тРНК), т. е. доли ее оснований, входящих в Уотсон-Криковские комплементарные пары и ответственных за образование спирали-зованных участков [82]. На рис. 36 показана зависимость величины ткр от концентрации тРНК в растворе для нативной ДНК (кривая 1), для денатурированной ДНК (кривая 3) и для тРНК (кривая 2). Интерполяция дает для последней степень спирали-зации около 0,8, что хорошо совпадает с рядом прежних данных, полученных другими методами.
Тем же методом удалось по- тнр,цсек казать, что при инкубации 1
тРНК с рибонуклеазой поджелудочной железы атака ри-бонуклеазы, по крайней мере в наших условиях (при избытке ионов Mg), направлена в первую очередь на однотяжевые участки и не затрагивает двух-тяжевых [83]. В сочетании с поляризационными измерениями,
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 133 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed