Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Эффективность процессов преобразования поглощенной молекулой энергии в излучаемую характеризуется значениями энергетического или квантового выхода флуоресценции. Строгие определения этих величин следующие.
1. Энергетическим выходом флуоресценции называют отношение энергии, излученной веществом за некоторое время, к энергии, погло-
щенной им за это же время. Иными словами, если W„зл есть мощность (интенсивность) излучения, а Wn0m — мощность поглощения, то энергетический выход флуоресценции
W
^ изл / л »\
W—¦ <44>
w ПОГЛ
При этом предполагается, что наблюдения ведутся в стационарном режиме, когда уже достигнуто равновесие между поглощением и излучением, и величины №тл и Wnoимеют постоянные значения. Практически в интересующих нас случаях требование стационарности не накладывает дополнительных экспериментальных ограничений, так как стационарный режим флуоресценции устанавливается за очень короткое время — порядка 10“8—10-9 сек.
2. Квантовым выходом флуоресценции называют отношение числа квантов, излучаемых системой в стационарном режиме за единицу времени (птл), к числу квантов возбуждающего излучения, поглощенных системой за то же время (плогл),
п
ИЗЛ /А*>\
Р = -------. (45)
ПОГЛ
Эта величина представляет собой, очевидно, вероятность того, что молекула, поглотившая квант возбуждающего света, испустит квант излучения флуоресценции.
Если мы определим среднее значение частоты излучения (<Ч')И:1Л) и среднее значение частоты поглощенного кванта возбуждающего излучения (<v>no™) при помощи соотношений
ftvanh (,У)нзл — ^изл! ^погл^ (v)nor>i — ^погл) (46)
то связь между значениями 'квантового и энергетического выхода флуоресценции, очевидно, определится соотношением
^^ИЗЛ /Л’7\
т]=—-------р. (47)
^^погл
Закон Вавилова. Фундаментальное соотношение между выходом флуоресценции и длиной волны (частотой) возбуж-
1 Зная спектральное распределение интенсивности флуоресценции по частотам (/v), которое при стоксовском возбуждении не зависит от частоты возбуждения, можно вычислить среднюю частоту излучения из соотношения
Среднюю частоту поглощенного кванта <(v>noniтакже можно вычислить, если известны спектр возбуждающего излучения н спектр поглощения данного вещества.
Рис. 29. Зависимость энергетического выхода флуоресценции от длины волны возбуждающего света [581
Рис. 30. Проверка закона Вавилова для большой группы флуоресцирующих веществ [59]. Относительный квантовый выход люминесценции в зависимости от длины волны возбуждающего света
/ — родамин; 2 —эскулин; 3— урановое стекло; 4 — роза бенгальская; 5 — нафтол; в — родамин кислый; 7 — сульфорода-мин; 8 — хннин бисульфат; 9 — бензофлавин; 10— эозин; И — трнпафлавнн; 12 — флуоресцеин; 13 — акридин; 14 — эри-трозин
дающего света, установленное С. И. Вавиловым [57] и носящее поэтому его имя, гласит: 'в стоксовской части спектра поглощения квантовый выход флуоресценции не зависит от длины возбуждающего света; в антистоксовской части спектра он быстро спадает с увеличением длины волны (уменьшением частоты) возбуждающего света1.
Так как при стоксовской возбуждении спектр излучения и, стало быть, значение средней частоты излучения <^>изл не зависят от длины волны возбуждающего света, то из постоянства квантового выхода и соотношения (47) следует, что в этой области энергетический выход флуоресценции линейно падает с увеличением частоты (уменьшением длины волны) возбуждающего света (рис. 29).
Сформулированная выше закономерность, установленная Вавиловым на примере растворов флуоресцеина, носит универсальный характер. Она была проверена и подтверждена для большого числа веществ различной природы (рис. 30).
Закон спадания квантового выхода флуоресценции в антистоксовской области и влияние на него температуры более детально исследованы в работе [58]. Было показано, что этот закон имеет экспоненциальный характер (рис. 31). Эти результаты были недавно проверены и подтверждены в работе [60].
Постоянство квантового выхода во всей стоксовской области возбуждения имеет ту же физическую причину, что и независимость формы спектра флуоресценции от длины волны возбуждающего света. Она заключается в том, что за время, очень малое по сравнению с длительностью возбужденного состояния, успевает установиться постоянное распределение возбужденных молекул по нижним колебательным подуровням 'первого возбужденного (флуоресцентного) состояния. К моменту излучения
