Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лазуркина Ю.С. -> "Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот" -> 76

Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.

Лазуркина Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот — Наука, 1967. — 343 c.
Скачать (прямая ссылка): fizmetodiisledovaniyabelkov1967.djvu
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 133 >> Следующая

у-Ю'ксенч
к, ммк
Рис. 28. Профиль полосы флуоресценции раствора акридинового оранжевого в шкале длин волн (1х, кривая 1\ ось абсцисс внизу) и в шкале частот (Iv, кривая 2, ось абсцисс наверху)
или кварца. В монохроматорах первого типа дисперсия линейна, т. е. длина волны выделяемого излучения практически прямо пропорциональна углу поворота решетки. В силу этого оптическая ширина щели прибора в шкале длин волн Ah остается постоянной при всех длинах волн. В призменных монохроматорах с уменьшением длины волны дисперсия растет, и оптическая ширина щели АА, соответственно уменьшается. С достаточным приближением можно считать
что АХ ~ — .
А2
Из этого ясно, что в монохроматорах с дифракционной решеткой мощность измеряемого излучения пропорциональна спектральной ин-
тенсивности в шкале длин волн: W^—'h- Чтобы получить относительные значения Iv, нужно измеренные значения мощности умно-№
жить на — (41). При применении призменных монохроматоров для
о
получения относительных значений 1\ нужно измеренные значения мощности W% умножить на к2, а чтобы получить относительные значения Iv, нужно умножить W% на X4.
Монохроматоры с дифракционной решеткой имеют в прикладных, в частности люминесцентных, исследованиях ряд весьма существенных преимуществ. Важнейшим из них является линейность дисперсии и вытекающее из нее постоянство ширины оптической щели по всему спектру (в шкале длин волн). Это существенно облегчает построение регистрирующих установок с автоматической записью кривых спектрального распределения на самописце и дает возможность работать с достаточно широкими щелями и в длинноволновой (красной) области спектра. К сожалению, однако, все монохроматоры, выпускаемые отечественной промышленностью (типы УМ-2, ЗМР-З и ДМР-4), являются призменными.
Приемники излучения и калибровка установок. При работе в видимой и ультрафиолетовой областях в качестве приемников излучения сейчас применяют почти исключительно фотоэлектронные умножители (ФЭУ). Эти приемники являются селективными, т. е. чувствительность их к излучениям различных длин волн неодинакова. Кроме того, и пропускание света всей спектральной установкой также селективно. Поэтому измеряемый фототок отнюдь не пропорционален мощности излучения, выделяемого монохроматором из состава данного излучения. Если обозначить функцию спектральной чувствительности ФЭУ через S (?*,), пропускание прибора — через Т(Х) и измеренный фототок — /(X), то истинная мощность данного потока излучения
W (X) = — . (43)
W S(X)T (X)
Поэтому для измерения мощности ЩЯ,) и вычисления значений .спектральной интенсивности Л, или [v спектральную установку следует калибровать, т. е. получить систему множи-
телей КЩ = ------------, на которые нужно умножить показа-
S (^) Т(Х)
ния измерительного прибора для получения истинных относительных значений W(i). Проще всего это осуществляется при помощи эталонных ламп, т. е.'источников света с точно известным спектральным расределением .мощности. Поместив такую лампу в то место, где при нормальной работе находится кювета с флуоресцирующим раствором, снимают на данной установке спектр лампы. Сравнив полученную кривую с точно известной
для эталонной лампы ‘кривой, получают искомую систему поправочных коэффициентов К(Х). Калибровку следует повторять не реже раза в год и производить ее заново при смене ФЭУ даже в том случае, когда новый ФЭУ принадлежит к тому же типу и марке, что и старый.
Нормировжа спектральных к:ривых. На практике измерения абсолютного значения мощности излучения, выделяемого монохроматором, производятся очень редко. Обычно измеряют относительные значения величин 1% или Iv, принимая за единицу их значения при определенной длине волны. Чаще всего за единицу принимают значения /я или Iv в максимуме (или в одном из максимумов) спектральной полосы флуоресценции. Такой способ дает возможность наглядно судить о форме или профиле этой полосы.
Такой же способ нормировки применяется обычно для сравнения спектров различных веществ или спектров, снятых при разных условиях. Каждый спектр при этом нормируется по своему максимуму. В некоторых случаях, особенно тогда, когда сравниваемые спектры существенно отличаются по ширине, предпочтительнее нормировать их по площади, т. е. так выбирать масштабы для сравниваемых спектров, чтобы площади под всеми кривыми были равны. Наконец, иногда- бывает полезно нормировать спектры так, чтобы площади кривых под ними оказались пропорциональными значениями 'квантовых выходов соответствующих растворов.
г. Энергетический и квантовый выход флуоресценции
Определение. В биологических (и вообще прикладных) исследованиях очень часто сопоставляют значения интенсивности (мощности) флуоресцентного излучения в разных объектах и при разных условиях. Следует подчеркнуть, что эта величина, даже измеренная при постоянной интенсивности возбуждающего света, т. е. отнесенная к единице мощности возбуждающего излучения, не имеет определенного физического смысла и не может служить характеристикой изучаемой системы. Информационная ценность ее чрезвычайно ограничена. iB самом деле, если в том или другом случае мы наблюдаем изменение интенсивности флуоресценции, то без контроля сопутствующих изменений поглощения ничего не можем сказать об изменении эффективности самого процесса флуоресценции.
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 133 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed