Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Правило Стокса. Стоксовская и антистоксов-ская флуоресценция. В большинстве случаев, с которыми приходится встречаться на практике, вся полоса флуоресценции лежит в области больших длин волн (или меньших частот), чем возбуждающее излучение. Так, например, обычно красная флуоресценция возбуждается зелеными, синими или ультрафиолетовыми лучами, зеленая — только синими и ультрафиолетовыми. Обобщая такого рода наблюдения, Стокс в 1852 г. сформулировал свое знаменитое правило о том, что частота света флуорес-
ценции всегда меньше частоты возбуждающего света. В такой жесткой формулировке, однако, это правило неверно и должно быть заменено более мягким «правилом Ломмеля» (стр. 177).
Мы говорили уже о том, что спектр флуоресценции всегда сдвинут в длинноволновую сторону по отношению к спектру абсорбции, но на некотором участке длин волн (см. отрезок ab на рис. 25) оба эти спектра перекрываются. Ясно, что пока мы избираем возбуждающий свет в той части спектра поглощения, которая лежит влево (в сторону меньших длин волн или больших частот) от границы
спектра флуоресценции, правило Стокса, очевидно, имеет силу. Но когда возбуждение производится длинами волн, лежащими в области перекрытия спектров (между точками а и Ь), то правило Стокса могло бы сохранять силу лишь в том
случае, если бы спектр флуоресценции резко изменялся и в нем отсекалась бы вся та часть, которая соответствует Рис. 27. Спектральное распределение длинам ВОЛН, меньшим (или
интенсивности флуоресценции рас- частотам — большим), чем у
твора родамина Б в пропиловом спир- Rn4fiv^atmTrprn rRP ' Огтня
те при стоксовском возбуждении (/) возоуждающего света, одна
и при антистоксовском возбуждении КО ЭТОГО, как МЫ видели ВЫ-
линией натрия 589 ммк (2) [57] ше, нет. Изменения спектра
флуоресценции при возбуждении малыми частотами, лежащими в области перекрытия спектров, очень незначительны (рис. 27), и в спектре флуоресценции всегда имеется более или менее значительный участок длин
волн, меньших, чем длина волны возбуждающего света. Таким
образом, при возбуждении флуоресценции светом, лежащим в области перекрытия спектров поглощения и флуоресценции, правило Стокса нарушается. Эта часть спектра поглощения называется поэтому «антистоксовской», в отличие от более коротковолновой, «стоксовской» области. Равным образом, часто говорят о «стоксовской» и «антистоксовской» части спектра флуоресценции в зависимости от того, соответствует ли она длинам волн, большим или меньшим, чем длина волны возбуждающего флуоресценцию излучения. На антистоксовскую часть спектра может приходиться весьма значительная доля всей мощности флуоресценции. В примере на рис. 27 при возбуждении флуоресценции раствора родамина Б в пропиловом спирте линией натрия с длиной волны 589 ммк заштрихованная площадь антистоксовской
Л, ммк
части спектра флуоресценции составляет около 40% всей площади под спектральной кривой.
В рамках классической физики правило Стокса не могло быть объяснено и рассматривалось как чисто эмпирическая и довольно загадочная закономерность. Однако уже в первых работах Эйнштейна по квантовой (фотонной) теории излучения оно получило вполне естественное толкование. Действительно, так как энергия фотона (поглощаемого или излучаемого кванта) пропорциональна частоте излучения (E=hv), то смысл правила Стокса заключается в том, что величина излучаемого кванта обычно меньше, чем величина кванта поглощенного, т. е. процесс превращения частоты излучения обычно идет с потерями энергии электронного возбуждения, частично превращающейся в тепло. В случаях нарушения правила Стокса излучается квант больший, чем поглощенный, т. е. величина кванта возрастает за счет тепловой энергии системы. Это вполне может иметь место, например, тогда, когда происходит переход с некоторого колебательного подуровня верхнего электронного состояния на более низкий колебательный подуровень основного состояния по сравнению с исходным (см. рис. 23).
в. Техника спектрально-флуоресцентных исследований
В рамках настоящей статьи мы не можем остановиться подробно на описании различных установок и приборов, применяемых для изучения спектрального распределения мощности излучения. Отметим лишь несколько принципиальных моментов.
Построение кривых спектрального распределения интенсивности излучения в шкале длин волн и в шкале частот. Спектры флуоресценции принято графически представлять в виде кривых, изображающих зависимость «спектральной интенсивности» излучения от длины
волны (Я) или частоты (v=—) соответствующих монохроматиче-
Л
ских излучений (с — скорость света). Примеры такого рода графиков, которые часто называют также «профилями» спектральной полосы излучения, были даны выше на рис. 24—27. Чрезвычайно важно уточнить физический смысл величин, которые мы называем «спектральной интенсивностью» (в шкале длин волн или в шкале частот) и значения которых мы откладываем по оси ординат на наших графиках. Это необходимо как для перехода от результатов непосредственного измерения мощности излучения к истинным значениям спектральной интенсивности, так и для того, чтобы, зная распределение в одной из шкал (например, в шкале длин волн), можно было вычислить распределение в другой шкале (в частотах).
