Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Зеркальная симметрия наблюдается так>ке для ряда полу-сложных молекул, в том числе и таких, в спектрах которых имеется колебательная структура. Однако в то время, как для типичных сложных молекул она сохраняется и при понижении темпе-
’,2 Физические методы исследования белков
177
ратуры, в случае полусложных молекул эта симметрия при низких температурах нарушается. Таким образом, степень зеркальности всегда увеличивается по мере усложнения молекул и точное ее выполнение является лишь предельным случаем. Конечно, здесь имеется в виду «сложность» молекулы в указанном выше спектроскопическом, а не химическом смысле.
Теоретически вопрос о тех особенностях внутреннего строения молекул, которыми обусловлена зеркальная симметрия спектров поглощения и излучения, был рассмотрен В. Л. Левшиным [45]. Строгое обоснование правила зеркальной симметрии на основе общих представлений квантовой теории дал Д. И. Блохинцев [56]. Соотношения зеркальной симметрии вытекают также из общей формулы Б. И. Степанова для формы спектров абсорбции и люминесценции сложных молекул. Вся эта совокупность вопросов представляет очень большой интерес с точки зрения теории спектров сложных молекул, но не имеет особенно существенного значения для практических применений люминесценции в проблемах биохимии и молекулярной биологии. Поэтому мы не будем останавливаться на них подробно. Читатель может обратиться к монографиям [41] и [42], в которых найдет ссылки на соответствующие оригинальные работы.
Независимость спектра флуоресценции от длины волны возбуждающего света. В отличие от атомов и простых молекул, спектр излучения которых зависит от способа возбуждения, профиль полосы флуоресценции сложных органических молекул не зависит ни от длины волны возбуждающего света, ни даже от того, возбуждается ли флуоресценция светом, ударом электронов или каким-нибудь иным способом. Только при возбуждении светом большой длины волны (малой частоты), лежащим в области перекрытия спектров поглощения и флуоресценции (отрезок ab на рис. 25), наблюдаются некоторые незначительные изменения формы полосы излучения.
Физический смысл этой фундаментальной закономерности легко понять из рассмотрения схемы энергетических уровней молекулы (см. рис. 23). В результате поглощения света различной частоты как простые молекулы или атомы, так и сложные молекулы могут оказаться в одном из возбужденных состояний Si, S2, S3. В случае атомов или простых молекул мы наблюдаем в спектре излучения свет с частотами, соответствующими переходам с высшего достигнутого возбужденного уровня на различные другие нижележащие уровни. Если, например, молекула была возбуждена до уровня S3, то в спектре могут наблюдаться линии, соответствующие переходам S3-*S2, S3-*Si, S3->S0, а также «каскадным» переходам S2-+Sь S2-+S0 и Si-*-S0. Если молекула была возбуждена только до уровня S2, то, очевидно, первые три линии в спектре излучения возникнуть не могут. Таким образом, спектр излучения зависит от характера возбуждения.
Напротив, в случае сложных молекул мы всегда, независимо от того, на каком уровне находилась молекула непосредственно после поглощения света, наблюдаем только флуоресценцию, соответствующую переходам из самого нижнего возбужденного состояния Si в основное состояние S0. Это означает, что очень быстро, т. е. за время, много меньшее, чем длительность флуоресцентного состояния Si, все молекулы, находящиеся на более высоких уровнях, переходят на уровень Si, причем эти переходы не сопровождаются излучением и избыток энергии переходит в тепло. Этот процесс часто называют процессом внутренней конверсии энергии электронного возбуждения в тепло. Наличие внутренней конверсии и составляет основную отличительную особенность «сложных» (в спектроскопическом смысле) молекул.
Спектр флуоресценции этих молекул не зависит также и от того, на каком из колебательных подуровней флуоресцентного состояния Si оказываются молекулы после поглощения света или после конверсии энергии более высоких возбужденных состояний. Это означает, что за время, много меньшее, чем длительность возбужденного состояния Si, успевает установиться некоторое постоянное распределение молекул по колебательным подуровням этого состояния. Наблюдаемая флуоресценция всегда исходит из этого уже установившегося распределения. В случае растворов это может объясняться тем, что вероятность обмена колебательной энергией со средой для сложных молекул очень велика и значительно превосходит вероятность переходов между различными уровнями. Но независимость спектров флуоресценции от длины волны возбуждающего света наблюдается и в случае паров сложных молекул. Стало быть, объяснение подобного явления следует искать в особенностях самих молекул.
Практически указанная выше закономерность весьма важна, так как она дает возможность контролировать флуоресцентную чистоту исследуемых веществ. Только в том случае, если для всего спектра поглощения показана независимость спектра флуоресценции от длины волны возбуждающего света, мы можем быть уверены в отсутствии примесей или, по крайней мере, флуоресцирующих примесей. Этот способ контроля чрезвычайно чувствителен, и каждое люминесцентное исследование можно рекомендовать начинать с его применения.
