Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Метод дисперсии оптической активности для нуклеиновых кислот оказывается менее полезным, чем для белков и полипептидов. Как указывалось в начале главы, при образовании полинуклеотидов не происходит заметного расщепления полос поглощения оснований. В соответствии с этим дисперсия оптической активности полинуклеотидов в спиральной и клубковой конформации удовлетворяет одночленному уравнению Друде (30) в области спектра от 300 до 600 ммк и поэтому нет такого удобного параметра в уравнении, описывающего дисперсию оптической активности, как Ь0 для полипептидов и белков.
Параметры уравнения (30) для ДНК имеют следующие значения: а = 39,0, Хс = 234 ммк — для нативной ДНК спермы лосося и а = 40,0, Хс= 244 ммк — для нативной РНК печени крысы.
Исследование аномальной дисперсии оптической активности нуклеиновых кислот позволило связать образование вторичной структуры с положением и величиной амплитуды кривой аномальной дисперсии оптической активности. На рис. 18, Л и 18, ? [33] представлены кривые аномальной дисперсии оптической активности для ДНК и РНК соответственно. Приведены кривые аномальной дисперсии оптической активности, отвечающие
различным конформациям нуклеиновых кислот. Как в случае ДНК, так и в случае РНК кривые аномальной дисперсии оптической активности претерпевают изменения при переходе макромолекулы от одной конформации к другой.
Несомненный интерес представляют измерения аномальной дисперсии оптической активности и циркулярного дихроизма в полосе поглощения синтетических полинуклеотидов, в частности полирибоадениловой кислоты (полиА) и коротких однонитевых фрагментов полирибоадениловой кислоты вида АрА (две молекулы аденозина соединенных фосфодиэфирной связью), которые
[Rj-fir*
Рис. 19. Аномальная дисперсия оптической активности 1 — полиА при 22° С, pH 7,0; 2 — димеры аденина АрА при 25° С, pH 5,9; 3 — мономеры аденина Ар прн 25° С, pH 5,9. При этих условиях полиА находится в состоянии однонитевых спиралей
Рис. 20. Спектры циркулярного дихроизма (1) и поглощения (2) димеров аденина АрА
в дальнейшем для простоты мы будем называть просто димерами аденина [34, 35]. Эти измерения можно привести как иллюстрацию успешного применения методов исследования оптической активности для определения структуры биополимеров. Кривые аномальной дисперсии для полиА и димеров аденина имеют асимметричный вид (рис. 19) и очень напоминают схематические кривые аномальной дисперсии оптической активности, изображенные на рис. 13 на основании рассмотрения простейшей модели Куна. То же можно сказать и про кривые циркулярного дихроизма (рис. 20). Интересно заметить, что уже димеры аде-нинэ (см. рис. 19, кривая 2) обладают аномальной дисперсией оптической активности с такой же асимметричной кривой, как для полиА при pH 7,4.
При измерении оптической активности было установлено, что, кроме двухнитевой спиральной структуры полиА при pH 4,5, в стабилизации которой определенную роль играют водородные связи, образующиеся между нитями, существует однонитевая спиральная структура полиА, стабилизация которой при нормальных pH в основном определяется вандерваальсовым взаимодействием соседних оснований вдоль цепи макромолекулы.
Измерение циркулярного дихроизма димеров аденина позволило определить угол между осцилляторами, а, следовательно, и угол между основаниями в димере (35].
Рис. 21. Аномальная дисперсия опти-ческой активности комплексов ДНК фага Т2 с акридиновым оранжевым 1—нативная ДНК в концентрации 2- 10-5 М, концентрация акридинового оранжевого 1 ¦ 10~5 М-, 2 — денатурированная ДНК в концентрации 1,6 • 10-5 М; концентрация акридинового оранжевого 1,2 ¦ 10—5 М. Раствор в цитратном буфере 0,001 pH 6,0
сс, сем.
Рис. 22. Аномальная дисперсия оптической активности комплекса нативной ДНК фага Т2 с пинацианолом. Концентрация ДНК 1,2 '10~5М; концентрация пинацианола 3'10~в М. На одну молекулу красителя приходятся четыре нуклеотида ДНК. Раствор в цитратном буфере 0,001 М, pH 6,0
Как видно из сказанного, наиболее интересные сведения о структуре биополимеров можно получить при измерении кривых аномальной дисперсии оптической активности и кривых циркулярного дихроизма в ультрафиолетовой области спектра, что, однако, связано со значительными экспериментальными трудностями. В связи с этим нельзя не упомянуть о методе исследования биополимеров при помощи измерения аномальной дисперсии оптической активности красителей, связанных с биополимерами. Плоская, оптически неактивная молекула красителя, связываясь .с.биополимером, становится оптически активной, причем величи-
на и форма кривой аномальной дисперсии отражают в той или иной степени структуру биополимера [36].
Связываясь с нативной ДНК, молекулы акридинового оранжевого становятся оптически активными и показывают аномальную дисперсию оптической активности в полосе поглощения комплекса (рис. 21, кривая 1). При связывании того же красителя с денатурированной ДНК аномальная дисперсия оптической активности этого комплекса становится совершенно другой (рис. 21, кривая 2).
