Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
В тех случаях, когда в белках встречаются спиральные участки другого знака, метод оптической активности неприменим.
Развитие фотоэлектрических спектрополяриметров позволило измерять аномальную дисперсию оптической активности непосредственно в полосах поглощения вещества. Подобные измерения дают возможность непосредственно измерять точное положение оптически активных полос поглощения и их силу вращения [25]. Однако эти измерения очень затруднены и могут быть выполнены пока лишь на уникальных приборах. Измерение аномальной дисперсии в полосах поглощения позволяет усовершенствовать уравнения, описывающие дисперсию оптической активности в видимой и ультрафиолетовой областях. На рис. 16 представлена аномальная дисперсия оптической активности для спиральной и клубкообразной формы поли-у-метоксиэтил-/.-глу-тамата [31]. Из рис. 16 видно, что кривая аномальной дисперсии
оптической активности спирального полипептида пересекает ось абсцисс в двух точках — 225 и 193 ммк.
Основываясь на полученных результатах, Шехтер и Блоу [31] предложили использовать двучленное уравнение Друде (35) с ,\i = 193 ммк и Яг = 225 ммк для описания дисперсии оптической активности в видимой и ближней ультрафиолетовой области спектра.
Оказалось, что для полипептидов и белков определенные графически константы а,\ и а2 уравнения (35) являются линейными функциями степени спиральности.
Степень спиральности, определенная из значений этих коэффициентов для различных белков и полипептидов, оказалась очень хорошо согласующейся со степенью спиральности, определенной по гипохромному эффекту и методом рентгеноструктурного анализа.
Предложенное двучленное уравнение Друде, несомненно, имеет больший физический смысл, чем эмпирическое уравнение Моффи-та с Яо = 212 ммк. По-видимому, метод Шехтера и Блоу является в настоящее время наиболее совершенным.
Тем не менее правильность такого подхода недостаточно обоснована. Дело в том, что в области 180—230 ммк спектр поглощения полипептидов состоит из трех полос: двух полос с максимумами при 191 и 206 ммк, образовавшихся в результате расщепления
я-*я*-полосы амидной группы, и одной га^я*-полосы (225 ммк). Поэтому дисперсию оптической активности нужно было бы описывать трехчленным уравнением Друде.
Для выяснения вопроса о том, какие же полосы дают основной вклад в дисперсию оптической активности (дисперсия оптической активности одинаково хорошо описывается как уравнением Моффита, так и уравнением (35), точно так же, как хорошо опишется трехчленным уравнением Друде), необходимы более тщательные экспериментальные и теоретические исследования этого вопроса.
Рис. 16. Дисперсия оптической активности в области собственного поглощения синтетического полипептида поли-'у-метоксиэтил-/.-глутамата
1 — спиральная форма; 2 — клубкооб-разная форма
11 Физические методы исследования белков
161
г. Дисперсия оптической активности нуклеиновых кислот
Можно заранее сказать, что, поскольку молекулы нуклеиновых кислот состоят из звеньев, содержащих асимметрические атомы, они должны обладать оптической активностью. Оказывается, что пуриновые основания дают в видимой области спектра отрицательное вращение, в то время как пиримидиновые основания дают близкое по величине, но положительное вращение
Рис. 17. Кривые плавления тимусной ДНК
/ — измерена по изменению оптической плотности при 259 ммк; 2 — измерена по изменению удельного вращения [а]?>
плоскости поляризации. Раствор одинаковых концентраций пуриновых и пиримидиновых оснований оказывается почти неактивным. Того же результата можно ожидать для полностью разупорядоченной (клубковой) конформации нуклеиновых кислот, что и наблюдается на опыте. Однако, как и для полипептидов, вторичная структура нуклеиновых кислот дает вполне заметное положительное вращение. Удельное вращение, измеренное при длине волны 589 ммк, для ДНК из спермы лосося равно 125°, а для РНК, выделенной из печени крысы,— 133°.
На основании различия в удельном вращении плоскости поляризации нуклеиновых кислот в нативном и денатурированном состоянии можно использовать измерение вращения плоскости поляризации в качестве метода для определения степени спиральности этих макромолекул. На рис. 17 [32] представлены кривые плавления ДНК, полученные по гипохромному эффекту
в полосе поглощения 259 ммк и по измерению удельного вращения.
Как видно, эти кривые плавления хорошо совпадают. С чем связано небольшое увеличение вращения в области температур от 50 до 80°, пока неясно. Не исключено, что в этой температурной области ДНК изменяет свою структуру.
Рис. 18. Кривые дисперсии оптической активности ^ — ДНК из спермы лосося: / — нативная ДНК в 0,15 AJ NaCl+0,15 М KF, pH 7,0; 2 — денатурированная ДНК в том же буфере при 90° С; 3 —то же + NaOH, pH 12,3; Б — РНК из печени крысы: / — нативная РНК в 0,15 М NaCI+0,01 М фосфатного буфера, pH 7,0 при 27° С; 2 — денатурированная РНК в том же буфере прн 90° С; 3 — денатурированная РНК в том же буфере + NaOH, pH 12,3
