Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
тем более, что имеется значительно более простой и доступный метод дисперсии оптической активности (см. параграф 3). Однако в ряде случаев, когда метод оптической активности неприменим (например, для смеси правых D- и левых L-спиралей), спектрофотометрический метод может оказаться весьма полезным. Используя гипохромный эффект при 190 -ммк, Розенхек и Доти i[6] определили степень спиральности полипептида, состоящего из D- и L-участков, а также нашли степень спиральности различных белков. Исследование белков осложняется тем, что боковые группы тоже поглощают в рассматриваемой области.
2. Инфракрасная спектроскопия
Прошедшее десятилетие характеризовалось энергичным и разнообразным применением инфракрасной спекроскопии для изучения различных классов биологически важных соединений: аминокислот, пептидов, стероидов, витаминов, липидов, полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот. Однако основная часть работ посвящена изучению спектров полипептидов и белков, и здесь достигнуты наибольшие успехи, чему способствовало развитие химии синтетических полипептидов. Около 15 лет назад исследование инфракрасного дихроизма в фибриллярных белках позволило высказать мысль о существовании спиральной конформации их молекул. Это было важным вкладом в наши знания о строении белков. Приблизительно с этого времени начинается широкое использование инфракрасной спетроскопии в молекулярной биологии в основном по трем направлениям: 1) в качестве аналитического средства; при этом строгое соответствие спектральной кривой структурной формуле исследуемого вещества позволяет однозначно различать соединения с небольшими структурными особенностями; 2) для определения структурных формул биологических соединений; 3) как метода для изучения пространственной конформации биополимеров.
В связи с развитием техники измерения инфракрасных спектров, в настоящее время получить их стало довольно просто. Точно так же относительно несложно может быть извлечена из спектров первичная информация. Последнее, однако, требует знания основ теории колебаний и происхождения инфракрасных спектров. Данный раздел знакомит читателей с основами теории инфракрасных спектров и особенностями применения метода инфракрасной спектроскопии к решению различных структурных и физико-химических задач молекулярной биологии.
а. Получение инфракрасных спектров
Происхождение инфракрасных спектров обусловлено главным образом колебаниями атомов в молекуле. Спектр, как правило, состоит из большого числа полос, причем для молекулярного
анализа важно то, что часть полос может быть приписана колебаниям отдельных атомов группировок, более или менее сохраняющих свойства в разных молекулах.
Доступный в настоящее время для широкого круга исследователей интервал длин волн инфракрасного диапазона простирается от 1 до 25 мк. В спектральных измерениях очень часто используется шкала волновых чисел (см~1), пропорциональных частоте. Волновое число — величина, обратная длине волны, выраженной в см. Указанный выше интервал в шкале волновых чисел (далее иногда в том же смысле употребляется термин «частота») равен 10 000—400 см~х. Частоты основных колебаний многоатомной молекулы (см. ниже) занимают область 4000—50 см~х, тогда как в близкой инфракрасной области находятся полосы поглощения, обусловленные обертонами и составными тонами.
Методы приготовления образцов в инфракрасной спектроскопии отличаются от методов, применяемых в ультрафиолетовой области спектра. Дело в том, что практически любой растворитель в инфракрасной области не является прозрачным, и поэтому записать спектр удается только в тех относительно небольших участках, где данный растворитель или не поглощает, или поглощает очень мало. Классические растворители, применяемые в инфракрасной спектроскопии — хлороформ, четыреххлористый углерод и сероуглерод, мало пригодны для изучения большинства биологически важных соединений (за исключением стероидов и липидов). Применение в качестве растворителя воды хотя и затруднительно, но в принципе возможно; при этом в области поглощения обычной воды используют растворы в тяжелой воде, однако следует иметь в виду процессы дейтерообмена водородных атомов некоторых групп, о чем будет сказано ниже.
В настоящее время значительно шире изучаются инфракрасные спектры биологических соединений в твердом состоянии. Для приготовления образцов из кристаллических соединений применяют в основном два метода: суспензирование в подходящей среде и метод прессованных таблеток. В первом методе в качестве иммерсионной среды широко используют парафиновые масла, а в областях их поглощения — фторированные или хлорированные углеводороды, прозрачные в указанных областях. Данный метод с успехом применяют также в тех случаях, когда вещество быстро вступает в реакцию с окружающей средой. Однако, несмотря на сравнительную простоту, этот метод имеет ряд серьезных недостатков: трудно контролировать толщину слоя, потери на отражение и рассеяние; запись спектра нельзя сделать при одинаковой толщине во всем диапазоне. Метод прессованных таблеток свободен от перечисленных недостатков. Было показано, что галоидные соли щелочных металлов, особенно бромистый и хлористый калий, могут быть сплавлены в прозрачные таблетки под давлением в несколько тысяч атмосфер в вакууме при ком-
