Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лазуркина Ю.С. -> "Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот" -> 53

Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.

Лазуркина Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот — Наука, 1967. — 343 c.
Скачать (прямая ссылка): fizmetodiisledovaniyabelkov1967.djvu
Предыдущая << 1 .. 47 48 49 50 51 52 < 53 > 54 55 56 57 58 59 .. 133 >> Следующая

Концентрацию белков и полипептидов определяют по спектрам связывающихся с ними красителей [8].
Определение степени спиральности и исследование перехода спираль — клубок в полинуклеотидах. Величина гипохромного эффекта пропорциональна количеству нуклеотидов, находящихся в спиральных участках молекулы. Поэтому для нахождения зависимости степени спиральности от какого-нибудь параметра (температуры, pH среды и т. д.) достаточно измерить зависимость от этого параметра величины гипохромного эффекта при какой-либо длине волны: удобнее всего проводить измерения при 260 ммк, так как при этой длине волны гипохромный эффект максимален. Обычно по оси ординат откладывают просто оптическую плотность D. Кривая зависимости оптической плотности от температуры -(рис. 6) называется кривой плавления, или кривой тепловой денатурации. Температура, при которой гипохромный эффект равен половине своего максимального значения, называется температурой плавления Тт полинуклеотида. Кроме того, кривые плавления биополимеров имеют конечную ширину А Т.
9 Физические методы исследования белков
129
Температура плавления нуклеиновых кислот определяется средней энергией связи, приходящейся на пару оснований. Поскольку разные пары А—Т (или А—У в случае РНК) и Г—Ц имеют различные энергии связи, температура плавления зависит от нуклеотидного состава. Температура плавления ДНК линейно растет с увеличением отношения Г+Ц/А + Г + Ц + Т. Следует отметить, что температура (и ширина интервала) плавления ДНК не зависит от молекулярного веса полимера.
Кривая плавления весьма чувствительна к наличию в растворе веществ, способных связываться с ДНК, например ионов во-
Рис. 6. Зависимость величины оптической плотности от температуры для ДНК фага Т2 в 10-3 М цитрат-ном буфере (низкая иониая сила)
дорода (т. е. pH среды), ионов металлов, молекул красителей (акридин оранжевый, профлавин и др.), некоторых антибиотиков (актиномицин), свободных нуклеотидов, РНКазы и т. д. (см. обзор [9]). Эти вещества меняют как температуру, так, в ряде случаев, и ширину интервала плавления.
При охлаждении образцов после нагревания величина гипо-хромного эффекта в той или иной степени восстанавливается. При нагревании до температуры, меньшей температуры конца плавления, при последующем охлаждении происходит практически полное восстановление. Если образцы нагревать выше температуры конца плавления, то гипохромный эффект восстанавливается не полностью при охлаждении ДНК, но практически всегда восстанавливается при охлаждении РНК.
Ренатурацией называется восстановление комплементарной спиральной структуры нуклеиновой кислоты при снятии действия
дёнатурирующего агента (например, при охлаждении). Почти полное восстановление величины гипохромного эффекта не означает, что произошла истинная ренатурация, так как образование участков с неспецифическим (некомплементарным) спариванием оснований также приводит к гипохромному эффекту. Чтобы отличить истинную ренатурацию от ложной, ДНК повторно нагревают [3]. Если при этом переход спираль — клубок будет таким же резким, как и при первом нагревании, то, значит, ренатурация была истинной; если он окажется размазанным по большому интервалу температур, то, следовательно, имело место неспецифическое спаривание. Быстрое охлаждение приводит к неспецифическому спариванию оснований, а медленное, особенно выдержка при температурах, несколько меньших температуры начала плавления, способствует истинной ренатурации.
При помощи измерений спектров нуклеиновых кислот можно определить нуклеотидный состав полимеров (10]. Это делается следующим образом. Было обнаружено, что спектр денатурации, т. е. разность между поглощением денатурированной и нативной нуклеиновой кислоты как функция длины волны, линейно меняется с изменением ГЦ-состава полимера. В частности, для ДНК
А8^ = (1— а)Д^Р + аЛе?ц. (19)
В этой формуле а — доля ГД пар в полимере; ДеаТ и Де?ц ¦— некоторые эмпирически найденные для каждой длины волны коэффициенты.
При помощи формулы (19) был найден ГЦ состав ряда нуклеиновых кислот [10]. Было показано [12], что формула (19) справедлива в области значений а от 0,3 до 0,7. Однако в этой же работе найдено,
что Ле?т и Де?ц значительно отличаются от соответствующих величин для синтетических полинуклеотидов (поли dr: dl\ и поли dAT :dkT). Это означает, что зависимость Де>. (а) не является линейной, но в определенном интервале значений ос может быть при современной точности измерения разностных спектров апроксимирована прямой линией. Отметим, что, поскольку гипохромный эффект обусловлен взаимодействием оснований вдоль, а не поперек цепи, формула (19) ни в коем случае не должна быть справедлива для всех возможных значений а. Можно показать, что при имеющейся экспериментальной точности справедливость формулы (19) в области значений а от 0,3 до 0,7 не противоречит существующим представлениям.
Определение степени спиральности полипептидов и белков спектрофотометрическим методом. Г ипохромный эффект полипептидов я белков максимален при длине волны 190 ммк. Поэтому исследования конфор-мационных изменений этих полимеров спектрофотометрическим методом весьма затруднительны и не получили распространения,
Предыдущая << 1 .. 47 48 49 50 51 52 < 53 > 54 55 56 57 58 59 .. 133 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed