Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
нимать любые значения, cos2cp = —. Таким образом, в нашем примере при об-
2
разовании «клубка» из отдельных мономеров поглощение длинноволновой полосы уменьшается на некоторую величину, а затем при переходе «клубок — спираль» поглощение вновь уменьшается на такую же величину.
На рис. 4 изображены кривые поглощения ДНК тимуса теленка в клубкообразном (верхняя кривая) и спиральном состояниях. ДНК растворялась в D20, чтобы продвинуться возможно дальше в коротковолновую область, однако спектры полностью совпадают со спектрами в Н20 в той области, где удалось произвести измерения в обычной воде.
Изменение формы кривой и ее смещение весьма незначительны. Основной эффект — значительное уменьшение поглощения при переходе клубок — спираль во всей исследованной области.
Этот гипохромный эффект обусловлен взаимодействием наблюдаемых полос с более коротковолновыми при стопкообразном расположении соседних вдоль цепи оснований в ДНК (см. табл. 1, Л). Действительно, так как основной вклад в поглощение дают я-^л;*-переходы, которые поляризованы в плоскости оснований, то стопкообразное расположение оснований означает стопкообразное расположение осцилляторов. Более коротковолновые полосы должны при этом испытывать ги-перхромный эффект. С другой стороны, осцилляторы, отвечающие п->-л;*-переходам, расположены вдоль одной прямой (параллельной оси спирали), так как эти переходы поляризованы перпендикулярно плоскости оснований. Поэтому длинноволновый я->-я*-переход должен испытывать при взаимодействии с более коротковолновыми п-кгт*-переходами гиперхромный эффект. Как видно из рис. 4, слабая я—>-я*-полоса в окрестности 2820 А
Рис. 4. Спектры поглощения клубкообразной (верхняя кривая) и спиральной (нижняя кривая) ДНК тимуса теленка в D20 [11].
действительно, быть может, не участвует в общем уменьшении интенсивности1. Так как я->я*- и /г-*я*-полосы имеют взаимно перпендикулярные поляризации, то их можно рассматривать независимо. Как видно из формулы (17), ортогональные полосы не взаимодействуют между собой.
д. Спектры полипептидов и белков
В отличие от полинуклеотидов, в полипептидах группа, дающая характерную для полипептида полосу поглощения в окрестности 190 ммк (амидная группа), образуется при поликонденсации аминокислот, так как она является пептидной связью. Поэтому полипептид можно представить в виде полимера, состоящего из мономерных звеньев — амидных групп, связанных между собой через а-углерод:
н н н
I I I
... — амид —С— амид —С— амид —С— . . .
I I ' !
Ri R2 R3
То, что амидные группы связаны между собой не непосредственно, а через а-углерод, позволяет считать, что между ними нет существенного обмена электронами и взаимодействие имеет в основном диполь-диполь-ный характер. В случае полипептидов и белков речь может идти вообще только об изменении поглощения при переходе клубок — спираль, так как при гидролизе рвется пептидная связь, обу-
180 190 200 210 2-20 230 словливающая поглощение.
Длина Волны, ммк Пептидная связь (см. рис. 3,
в) является плоской, так как
Рис. 5. Спектры поглощения спиральной я-орбиты делокализованы по (1) и клубкообразной (2) поли-1.-глута- трем атомам (JN, Ь, U) И
миновой кислоты [6] связь N—С носит частично
двойной характер. В амидной группе имеются три я-орбиты, две из которых заняты в основном состоянии, и одна — /г-орбита — локализована на кислороде (см. рис. 3, в).
1 В других опытах наблюдалось увеличение интенсивности этой полосы.
я->-я*-переходы поляризованы в плоскости группы, а п-*я*-переход запрещен. Однако он, по-видимому, проявляется у полипептидов в окрестности 225 ммк.
В 1959 г. Имахори и Танака обнаружили у полипептидов гипохромный эффект в окрестности 190 ммк, который подробно был исследован Розенхеком и Доти [6]. Спектры поглощения клубкообразной (верхняя кривая) и спиральной поли-?-глута-миновой кислоты изображены на рис. 5. Видно, что гипохромный эффект весьма велик. Как и в случае полинуклеотидов, можно предполагать, что этот гипохромный эффект обусловлен взаимодействием длинноволновой -полосы с более коротковолно-
вой л->-л;*-полосой.
е. Спектрофотометрия как метод исследования биополимеров
Спектрофотометрия широко используется при исследовании биополимеров. Здесь будут кратко рассмотрены лишь некоторые ее применения.
Определение концентрации нуклеиновых кислот. Поскольку оптическая плотность D пропорциональна концентрации поглощающих молекул в растворе, ее измерение часто используется для определения концентрации поглощающих свет молекул. Так «ак поглощение нуклеиновой кислоты зависит от состояния, в котором она находится (спиральном, клубкообразном или в частично спирализованном), то для определения концентрации ее необходимо предварительно привести к стандартным условиям. Измеряя затем поглощение раствора, можно определить концентрацию нуклеиновых кислот [7].
