Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лазуркина Ю.С. -> "Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот" -> 36

Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.

Лазуркина Ю.С. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот — Наука, 1967. — 343 c.
Скачать (прямая ссылка): fizmetodiisledovaniyabelkov1967.djvu
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 133 >> Следующая

Рис. 13. ДНК фага Сд. Использован метод извлечения молекул из раствора при помощи заряженной пленки. Наблюдаются длинные, ориентированные параллельно друг другу молекулы. Отношение длины тени к высоте объект?)
леиновых кислот. Аналитическим центрифугированием и исследованием вязкости препаратов высокополимерной рибонуклеиновой кислоты (РНК) до и после пульверизации установлено уменьшение молекулярного веса РНК [23]. Степень деградации зависит от режима пульверизации и типа пульверизатора.
Таким образом, использование в качестве подложки поверхности слюды в сочетании с нанесением препарата пульверизированием при всех достоинствах этого метода обладает тем недостатком, что не позволяет наблюдать длинные молекулы (типа ДНК) неразрушенными. Поэтому в настоящее время все большее распространение получают другие, более «мягкие» методы нанесения препарата.
Один из таких методов предложен Биром [24]. В качестве подложки в этом случае в первоначальном варианте использовали сополимер стирола и винилпиридина (40%). Предметной сеткой, покрытой пленкой такого сополимера, проводят по поверхности раствора ДНК. Молекулы ДНК в растворе заряжены отрицательно за счет ионизированных фосфатных групп. Плен-ка сополимера заряжена положительно, и молекулы ДНК прилипают к ее поверхности. Благодаря движению пленки возникает ориентация молекул в направлении ее перемещения (рис. 13). Оттенение в этом случае производится перпендикулярно направлению перемещения. Величина положительного заряда пленки пропорциональна количеству винилпиридина в ней и уменьшается с увеличением pH раствора, в котором находится ДНК. При помощи такой методики удалось наблюдать молекулы ДНК фага Т2 длиной до 50 мк [52] и ДНК фага Сд длиной до 38 мк [26]. Тонкую пленку из сополимера получить трудно, поэтому вместо нее в последнее время используют обычную углеродную пленку ([25, 27]. При сохранении остальных приемов в этом случае также можно получить микрофотографии длинных ориентированных молекул [53].
Методика Бира не исключает полностью возможность разрушения молекул. Они в этом случае вытянуты на подложке в одном направлении и при большом молекулярном весе достигают длины нескольких десятков микрон. Чтобы получить микрофотографию одной такой молекулы целиком, работая даже при сравнительно низком увеличении, приходится производить серию снимков, что представляет известное неудобство.
В настоящее время большое распространение получила методика, впервые предложенная Кляйншмидтом и Цаном [54]. Эта методика основана на взаимодействии нуклеиновой кислоты с низкомолекулярными белками и способности этих белков образовывать пленку на поверхности жидкости. Физико-химия образования такой пленки подробно описана в работе Трурни-та [55],
Рассмотрим два известных в настоящее время варианта методики на примере исследования, проведенного совместно с Р. Б. Хесиным н М. Ф. Шемякиным [56].
Один нз этих методических вариантов заключается в том, что молекулы извлекают нз раствора путем нанесения на его поверхность белковой пленки. В наших исследованиях для этих целей использовали раствор нуклеиновой кислоты в аммоний-ацетатном буфере (0,01 М, pH 7,0) с концентрацией 1—2 мкг/мл. Раствор наливали в плоскую круглую кювету площадью 80 см2 и на него наслаивали 0,02%-ный раствор цнтохрома с в том же
Рис. 14. Нанесение белковой пленки
/—пипетка; 2 —стеклянная палочка; 3 — белковая пленка; 4 — палочка из пластмассы; 5—вода; 6 — кювета
буфере, но 0,1 М. Белковую пленку наносили прн помощи стеклянного столбика, по которому спускали 0,1—0,2 мл раствора белка (рнс. 14). За образованием пленки следили по движению частиц талька, насыпанных на поверхность раствора. Пленку выдерживали на поверхности раствора 30 мнн. Часть молекул нуклеиновой кислоты взаимодействовала с белком н извлекалась из раствора. Пленку переносили на сетки с угольной пленкой, касаясь последними белковой пленки, обезвоживали абсолютным спиртом и высушивали на фильтровальной бумаге.
При другом методическом варианте готовили смесь, содержащую 0,5 мкг нуклеиновой кислоты и 0,2 мкг цнтохрома с в 1 мл 2 -М аммоннй-ацетатного буфера (pH 7,0). Смесь выдерживали в течение 4—5 мнн. н затем наслаивали 0,3—0,4 мл на поверхность дистиллированной воды илн 0,01 М аммоний-аце-татного буфера. Воду илн буфер наливали в плоскую прямоугольную кювету площадью около 800 см2. После образования пленки ее при помощи стеклянной палочки поджимали на 7з
Рис. 13 Фрагмент молекулы ДНК фага Т2. Обработка по t-.егодике К-пяйнш' ндга с последующим оттенением вращающегося образца
Рис. 16. Фрагмент молекулы ДНК фага Т2. Обработка по методике Кляйншмидта с последующим оттенением в одном направлении. Выявляются только участки молекул, ориентированные поперек направления оттенения
площади. Перенос белковой пленки на сетки и высушивание производили так же, как и в нервом варианте.
Исследованиями установлено, что при изготовлении образцов по методике Кляйншмидта ориентация молекул в белковой пленке в каком-либо направлении практически отсутствует. Это
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 133 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed