Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Негативное контра-с тирование. Если частицы исследуемого объекта, например вирусы или отдельные белковые молекулы, находятся на пленке-подложке в тонком слое аморфного вещества высокой плотности, то на экране микроскопа они будут выглядеть как светлые объекты на темном фоне. В этом и заключается принцип «негативного» контрастирования.
Впервые возможность негативного контрастирования была показана Холлом [31] и успешно использована Хаксли [32] при исследовании строения ВТМ. Бреннер и Хорн [33] усовершенствовали методику и выявили при ее помощи детали строения бактериофага Т2. В настоящее время эта методика широко используется для контрастирования различных вирусов [34—39], рибосом [40—42] и крупных белковых молекул [43—46].
Выбор веществ для негативного контрастирования определяется целым комплексом требований. Это вещество должно
иметь высокую плотность и быть стойким К воздействию электронного пучка. После его высыхания на подложке должен создаваться аморфный слой. Вещество 'использовать нельзя, если при взаимодействии с ним строение исследуемого объекта нарушается.
Наиболее распространено контрастирование 2%-ным водным раствором фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК), доведенным до необходимого значения pH добавлением КОН или NaOH. Микрофотография ВТМ, контрастированного ФВК, приведена на рис. 6. Примерно такое же контрастирующее действие оказывают вольфрамат натрия и молибденовокислый аммоний. Микрофотография вируса костра безостого, контрастированного 'молибденовокислым аммонием, показана на рис. 7.
Ниже приведены некоторые вещества, используемые для негативного контрастирования.
Иногда вещества, создающие негативный эффект, способны выявлять его строение и другим способом. Так, уранилацетат или уранилнитрат выявляют место расположения нуклеиновой кислоты. Если в процессе препарирования ионы уранила проникают внутрь головки фага, то они взаимодействуют с уложенной там молекулой нуклеиновой кислоты, увеличивая плотность. Капсула вируса в этом случае выглядит не светлой, а темной. В противовес негативному, такое контрастирование иногда называют позитивным.
Негативное контрастирование можно осуществлять, используя различные приемы. Чаще всего 1—2%-ный водный раствор контрастирующего вещества, предварительно доведенный до нужного значения pH, смешивают с суспензией исследуемых частиц. Полученную смесь или пульверизируют на пленку-подложку, или наносят пипеткой (небольшую каплю) и тут же отсасывают ее фильтровальной бумагой. Так как пульверизирование способствует деформации частиц .и создает худшие условия для распределения контрастирующего вещества на подложке [8], второй способ предпочтительнее. К тому же при пульверизировании возникают дополнительные трудности, если работу ведут с .инфекционным материалом.
Другой способ —это нанесение контрастирующего вещества на объект, который уже находится на пленке-подложке. В этом
Вещество
Безводная
плотность
Аммоний молибденовокислый
Уранилацетат ................
Уранилнитрат ................
Уранилформиат................
Фосфорновольфрамовая кислота Вольфрамат натрия............
2,89
3.7 3,69
3.8 4,2
Рис. 6, Вирус табачной мозаикн, контрастироваснный ФВК а — схематическое изображение ВТМ, находящегося в слое контрастирующего вещества; левая частица просматривается вдоль оси, правая — сбоку; б, в ~ ВТМ, контрастированный ФВК
случае сокращается до минимума время взаимодействия контрастирующего вещества с препаратом и меньше вероятность разрушения последнего.
Схематическое изображение частиц ВТМ, находящихся в слое ФВК, показано на рис. 6, а. Видно, что изображение частицы на экране или микрофотографии при таком методе контрастирования будет зависеть от степени ее погружения в слой плотного вещества. Частица, находящаяся в ФВК целиком, вся принимает участие в создании изображения. В этом случае внутренняя полость ВТМ заполняется ФВК, которая проникает также в «пустые» частицы сферических вирусов, занимая объем, предназначенный для нуклеиновой кислоты. Может быть и другой вариант, когда вирус погружен в ФВК неполностью. Тогда изображение будет создавать только некоторая его часть, например удаленная от подложки или близкая к ней. Иногда при исследовании спиральных структур и некоторых вирусов с ико-саэдрическими капсулами важно знать, какая сторона контра-стируется и создает изображение. Чтобы это установить, прибегают к различным приемам. Так, исследуя капсулу вируса папилломы человека, Клуг и Финч [37] просматривали стереопары микрофотографий частиц, контрастированных с одной стороны. Просмотр показал, что слой контрастирующего вещества (ФВК) выглядит расположенным между находящейся на переднем плане подложкой и изображением вирусной частицы. Так как препарат помещали в микроскопе подложкой в сторону источника электронов, такая картина свидетельствовала, что изображение возникает благодаря взаимодействию с ФВК стороны частицы, обращенной к подложке.
