Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
Большое значение имеет правильный выбор материала подложки. Собственная структура подложки должна быть незначительной по сравнению с размерами оттеняемых частиц. В качестве подложки для препарата при оттенении обычно используют коллодиевые или углеродные пленки. При использовании реплик с предварительным оттенением, о которых мы еще будем говорить, оттеняемый препарат обычно помещают на идеально гладкую поверхность слюды.
При выборе угла оттенения руководствуются главным образом профилем объекта и его размерами. В случае оттенения вирусов, белковых кристаллов, бактерий использовать углы, для которых tg 0<Vs нецелесообразно. Для оттенения нитевидных молекул, в связи с их малыми поперечными размерами, tg 0 уменьшают до Ум-
Измерив длину тени и зная угол оттенения, можно без особых затруднений по формулам (1—3) определить ‘высоту объекта. Рассмотрим эту операцию на примере вируса табачной мозаики (ВТМ). Как известно, ВТМ представляет собой цилиндрический полый стержень диаметром около 170 А, построенный из одинаковых, расположенных по спирали белковых субъединиц. На микрофотографиях этого вируса, контрастированно-го оттенением, его частица выглядит как палочка (см. рис. 3).
Чтобы определить диаметр частицы, необходимо измерить длину тени в направлении оттенения. Для этой цели удобно использовать частицы, ориентированные перпендикулярно направлению оттенения. Замеры показывают, что длина тени (/) составляет около 700 А. Отношение длины тени к диаметру частицы составляет в данном случае 4: I (tg0 = V4)- Простой расчет показывает, что диаметр ВТМ равен 170 А. При оттенении происходит накопление металла на объекте. Связанное с этим искажение реальных размеров оттененных частиц исследовалось при помощи измерения ширины частиц ВТМ, ориентированных параллельно оттенению. Оказалось, что их ширина увеличивается пропорционально количеству напыленного металла [16, 30]. На приводимой нами микрофотографии ширина таких частиц (5) составляет около 200 А, т. е. отличается от реальных размеров на 30—40 А. Это необходимо учитывать при определении размеров небольших частиц, например «сферических» вирусов. Размеры тех же частиц ВТМ, определенные по длине отбрасываемой тени, как мы показали выше, практически не отличаются от реальных размеров.
В тех случаях, когда по длине тени оценивают высоту объекта, важно-точно знать угол, под которым производится оттенение. Для увеличения точности можно пользоваться сферическими частицами латекса полистирола, наносимыми на подложку для оттенения вместе с препаратом. Непосредственное измерение на микрофотографии диаметра частиц латекса и длины тени от них позволяет установить угол, под которым происходило оттенение препарата на данном участке подложки.
Метод углеродных реплик с предварительным оттенение м. Метод реплик заключается в том, что рельеф поверхности объекта воспроизводится при помощи тонкой пленки, которая затем исследуется в электронном микроскопе. Существуют два основных способа изготовления реплик — одноступенчатый и двухступенчатый. При одноступенчатом способе исследуемый образец покрывают слоем вещества, передающим рельеф поверхности и образующим после отделения от образца реплику. При двухступенчатой методике с образца первоначально делают так называемый промежуточный отпечаток, с которого затем снимают реплику. Последний способ используется главным образом при исследовании поверхности массивных объектов в металловедении [6, 7, 12].
Одноступенчатый способ изготовления реплик получил широкое распространение при исследовании биологических препаратов. В этом случае в качестве материала пленки, воспроизводящей рельеф, используют формвар или коллодий (если не требуется высокое разрешение) и напыленные в вакууме слои углерода или кварца (если необходимо изготовить реплики с высоким разрешением). Мы будем рассматривать так называемые
5 Физические метопы исследования белков
18
углеродные реплики с предварительным оттенением, которые просты в изготовлении и являются, по-видимому, наиболее перспективными.
Для изготовления напыленных реплик используют те же вакуумные установки, что и для контрастирования оттенением. Испарение углерода проще всего производить термическим способом, который заключается в том, что электрический ток пропускают через два контактирующих между собой графитовых стержня. Одному из них придается форма острия (см. рис. 4, в). В месте контакта происходят интенсивный нагрев и испарение графита.
Чтобы обеспечить необходимую контрастность, реплики оттеняют. Если металл напыляют непосредственно на исследуемый образец, а затем наносят слой углерода, то образуется углеродная реплика с предварительно оттененного препарата или, как ее иногда называют, предварительно оттененная реплика (см. рис. 3, в). При использовании таких реплик структура исследуемого объекта передается наиболее точно, так как оттеняется непосредственно его поверхность.
В данном случае термин «реплика» не совсем точен, так как здесь углеродная пленка не служит для передачи рельефа исследуемой поверхности, а лишь несет на себе слой оттеняющего металла. После того как препарат оттенен и на него нанесен слой углерода, состояние препарата (если последний слабо рассеивает электроны) не будет сказываться на качестве изображения. Наблюдаемое в электронном микроскопе изображение ВТМ не изменится, например, если полученная углеродно-металлическая пленка будет предварительно обработана веществом, растворяющим вирус. Таким образом, в этом отношении функции, выполняемые обычной репликой, полностью сохраняются. Мы будем пользоваться термином «предварительно оттененная реплика», помня о сделанных здесь замечаниях.
