Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
меняется и описывается уравнением Лоренца:
ПН) = 10-
4+(
н—н.
Jh У
л )
Сверхтонкая структура. Обычно, кроме неспаренных электронов, исследуемые системы содержат ядра, обладающие собственными магнитными моментами (Я1, D2, Nli, С13,
F19 и т. д.). За счет взаимодействия электронных и ядерных магнитных моментов электронные зеемановские уровни подвергаются дополнительному расщеплению и возникает так называемая сверхтонкая структура (СТС) спектров ЭПР. Рассмотрим возникновение СТС на самом простом примере взаимодействия неспаренного электрона с одним протоном (ядерный спин i равен '/г, а его проекция на направление магнитного поля т, может принимать значения ±*/2). На схеме представлены уровни, возникающие в магнитном поле:
/
ms= +
/
\
\
1 +
+
Для компонент СТС действительно правило отбора А пи =0 (спин ядра не меняет ориентации при электронном переходе), в связи с чем в спектре будут наблюдаться две линии равной интенсивности. Если неспаренный электрон взаимодействует с двумя структурно-эквивалентными протонами, то возникают три равноотстоящие компоненты СТС с соотношением интенсивностей 1:2:1. Таким образом, анализ хорошо разрешенной СТС часто позволяет сделать однозначные выводы о строении исследуемых свободных радикалов, о локализации неспаренного электрона в определенных группах молекул.
Эффекты насыщения. При повышении СВЧ-мощности, падающей на образец, можно достичь такого уровня, когда спин-решеточная релаксация не будет успевать восстанавливать больцмановское распределение населенностей зеемановских уровней и эти населенности начнут выравниваться. Это приводит к уменьшению интенсивности линий ЭПР (при равных населенностях переходы сверху вниз и снизу вверх происходят одинако-
во часто и ЭПР-поглощения не наблюдается), и как показывает строгая теория, к искажению формы отдельной линии. Кривые насыщения, связывающие, например, интенсивность линий с мощностью СВЧ, определяются, таким образом, временем спин-решеточной релаксации Т\. Изучение кривых насыщения может помочь в расшифровке сложного спектра, возникающего за счет наложения линий СТС парамагнитных центров разной природы. Поскольку значения Тг этих центров различны, они будут по-разному вести себя в условиях насыщения.
г. Применение ЭПР в биологии
В кратком обзоре нет возможности подробно рассмотреть многочисленные работы, посвященные применению ЭПР-спектро-скопии в исследованиях биологически важных структур и процессов. Поэтому мы ограничимся перечислением некоторых направлений.
Изучение механизмов окислительно - восстановительных ферментативных реакций. Предположение об участии свободнорадикальных семихинонных форм различных коферментов.типа флавинов, хинонов и других в процессах аэробного и анаэробного окислительно-восстановительного ферментативного катализа появилось уже в 30-х годах нашего века после классических работ Михаэлиса по ступенчатому окислению. Однако прямое доказательство эта гипотеза получила лишь после применения метода ЭПР, позволившего непосредственно детектировать появление свободных радикалов этого типа в ходе биохимических процессов как в изолированных ферментных системах, так и в цельус клетках и тканях. В настоящее время методы ЭПР-спектроскопии широко применяются для исследования процессов транспорта электронов в митохондриях, строения и механизмов окисления и восстановления таких важнейших соединений, как коэнзим Qi0 и другие биологически активные хиноны, флавины, пиридиннуклеотиды, порфи-рины, металлопорфирины и хлорофилл. В ряде случаев удается проследить путь неспаренного электрона на всех участках цепи электронного переноса от флавина до иона меди цитохромокси-дазы. Изучение модельных систем и целых 'клеток методом ЭПР позволяет делать весьма существенные заключения о тонких деталях механизмов аэробного окисления и гликолиза,
о роли воды в этих процессах. Исследования так называемых ферментативных сигналов ЭПР начинают проводиться и в медицине, так как обнаруживаются достаточно четкие отличия в их интенсивности при некоторых патологических состояниях.
Радиобиологические исследования. Метод ЭПР широко применяется и при изучении механизма действия ионизирующего излучения на биологические системы. Обнаружены
и идентифицированы свободные радикалы и ион-радикалы, возникающие в целых клетках и тканях и в изолированных аминокислотах, пептидах, белках, нуклеиновых кислотах и т. п. под действием проникающего излучения. Особенно интересны исследования кинетики накопления и гибели свободных радикалов в зависимости от величины и мощности дозы, содержания воды, давления кислорода и т. д. Метод ЭПР впервые позволил подойти к решению вопроса о механизме действия защитных веществ, например серусодержащих соединений. Спектрометры ЭПР стали обязательным оборудованием современных радиобиологических лабораторий.
Фотобиология и фотосинтез. Фотохимические процессы обычно сопровождаются появлением свободных радикалов в качестве промежуточных продуктов. Современные чувствительные спектрометры ЭПР позволяют регистрировать и идентифицировать эти промежуточные соединения непосредственно в резонаторе прибора при освещении. Особенно интересна возможность однозначной идентификации возбужденных триплет-ных состояний. В триплетном состоянии спин системы равен единице, и, как правило, удается наблюдать сигнал ЭПР при g-факторе, близком к 4, соответствующий переходу с Ат = 2.
