Биохимия мембран. Рецепторы клеточных мембран. Том 4 - Кульберг А.Я.
Скачать (прямая ссылка):
щитовидной железы свиньи. Материал гомогенизируют механическим способом в
присутствии 0,2 М ди-иодсалицилата лития, после чего нерастворимые
компоненты удаляют центрифугированием. Все процедуры проводят в
присутствии ингибитора протеииаз - фенплметилсульфонилфторида. Лизат
мембраны первоначально фракционируют с помощью ионообменной
хроматографии, а затем путем гельфнльтрации на сефадексе. Фракции,
содержащие рецептор, используют для выделения рецепторного белка с
помощью иммобилизованного на биогеле тиротропина (М. N. Islam, N. R.
Forid, 1984).
Рецепторы эпидермального фактора роста (гормона роста), Рецептор
содержится на мембране различных клеток эпидермального и мезодермальпого
происхождения. Одна из эффективных процедур выделения рецептора состоит в
испотьзовании иммобилизованных моноклональных антитет против этого белка.
Экспериментальная процедура состоит в следующем (P. J. Parker, 1984).
Источником клеток, продуцирующих антитела против рецептора, служит
селезенка мышей, нммуинзирозапных раково эмбриональными клетками,
экспрессирующими в больших количествах рецептор для эпидермального
фактора роста. Эти клетки гибридизуют с клетками непродуцирующей
плазмацитомы по общепринятой методике получения гибридом, продуцирующих
антитела. Затем отбирают клоны гибридных клеток, синтезирующие антитела,
которые способны конкурентно блокировать связывание фактора роста.
Очищенные моноклональные антитела иммобилизуют на биогеле и сорбируют на
них солюбилизован-ные детергентом рецепторы. После удаления несвязавшихся
белков осуществляют элюцию рецептора с помощью N-ацетилгалак-тозамина.
Использование его для элюции рецептора продиктовано тем, что антитела
распознают в молекуле рецептора детерминанты олигосахаридной природы,
сходные по строению с антигенными детерминантами группового вещества
крови А1.
Выделение рецепторов на иммобилизованных лектинах. Многие рецепторы
содержат большой углеводный компонент, благодаря чему они эффективно
взаимодействуют с растительными белками - лектинами, связывающими
углеводы. Так как лекти-ны избирательно связывают различные по строению
сахара, гликопротеины, различающиеся по строению углеводных компонентов,
специфически связываются разными лектинами. Одним из первых этот
методический прием использовал П. Куатреказас (P. Cualvecasas, 1972) с
целью очистки рецептора инсулина. В настоящее время для выделения
указанного рецептора применяют иммобилизованный на агарозе лектин -
агглютинин из проростков пшеницы (wheat germ agglutinin). Для элюции свя-
1 О стпго " " антигенных детерминант групповых веществ крови см.:
Кульберг А. Я. Молекулярная иммунология. М. 1985.
10
заниого на сорбенте рецептора используют нейтральные буферные растворы,
содержащие N-ацетилглюкозамип и N, N'-днаце-тилхитобиозу - сахара,
входящие в структуру детерминант, распознаваемых указанным лектином.
Аналогичный метод используют, в частности, для очистки клеточного
рецептора а-интерферона. В этом случае агглютинин из проростков пшеницы
иммобилизуют на бромциансефарозе. Источником рецепторов служат
солюбилизированные с помощью тритона Х-100 мембраны лимфобластоидных
клеток человека. Элюцию рецептора с иммуиосорбента также производят с
помощью N-ацетилглюкозамина.
При анализе методов, используемых для выделения клеточных рецепторов,
обращает на себя внимание стремление к применению максимально щадящих
методов на стадии элюции рецептора с сорбента. Так, применение сорбентов
с иммобилизованными лактинами для очистки рецептора инсулина продиктовано
прежде всего стремлением избежать воздействия на рецепторный белок
растворов с низкими значениями pH, концентрированных растворов амидов
(мочевина) или других денатурирующих белок веществ. В то же время в
кислой среде (или с применением денатурирующих агентов) производится
элюция с иммобилизованных лигандов (антигены или гаптены) различных по
специфичности антител, не приводящая к их инактивации. Различие подходов
к способам элюции клеточных рецепторов и антител (иммуноглобулины) с
иммобилизованных лигандов, выбранных эмпирическим путем, связано с
конформационной лабильностью рецепторных белков. Так, для ряда изученных
к настоящему времени рецепторов (например, рецептор для эпидермального
фактора роста) характерны выраженные изменения конформации при переходе
из нейтральной в слабокислую среду (см. гл. 3).
Наиболее щадящие методы элюции рецепторных белков с иммобилизованных
лигандов могут заключаться в вытеснении рецептора с помощью структурного
аналога лиганда. Примечателен в этом отношении метод очистки р2-
адренергического рецептора. В качестве сорбента применяют
иммобилизованный на CL-сефарозе алпренолол, имеющий выраженное сродство к
упомянутому рецептору. Последующую элюцию рецептора с сорбента
осуществляли е помощью раствора алпренолола.
1.2. Маркирование рецепторов мечеными лигандами
Изучение строения и функциональных свойств рецепторов возможно без
