Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) - Кудряшов Ю.Б.
ISBN 5-9221-0388-1
Скачать (прямая ссылка):
3.2.2. Трансформирующая активность
Трансформирующая активность бактериальной ДНК часто оценивается по появлению специфических генетических маркеров у бактерий-реципиентов, «поглотивших» трансформирующую ДНК донора. Например, извлекают ДНК из бактерии, устойчивой к стрептомицину, и клетки стрептомицин-чувствительных мутантов
3. Феноменологический анализ радиационного повреждения
133
Рис. IV.3. Инфекционность ДНК фага tpX 174, препарат которого подвергнут воздействию 7-излучения 6°Со в вакууме
Рис. IV.4. Инактивация трансформирующей активности ДНК Bacillus subtilis при облучении сухих спор электронами с энергией 1 МэВ
инкубируют в ее присутствии. Если в результате этого путем рекомбинации происходит встраивание специфической последовательности нуклеотидов ДНК донора в геном реципиента, т. е. мутанты становятся устойчивыми к стрептомицину (генетический маркер), то на среде, содержащей стрептомицин, мутанты будут формировать колонии. Число таких колоний пропорционально доле молекул ДНК, сохранивших трансформирующую активность после облучения.
На рис- IVЛ показаны результаты опытов, в которых изучали трансформирующую активность ДНК после облучения электронами с энергией 1 МэВ. Для этого сухие споры Bacillus subtilis подвергали облучению, затем выделяли из них ДНК и инкубировали ее с клетками, не способными синтезировать индол (генетический маркер). Необлученная ДНК восстанавливала способность мутантных клеток синтезировать индол. Зависимость «доза-эффект» утраты трансформирующей активности ДНК после облучения является экспоненциальной.
3.2.3. Затравочная активность ДНК
Затравочная активность ДНК, т. е. ее способность служить матрицей для синтеза комплементарных нитей ДНК или РНК, также служит важным критерием для изучения инактивации нуклеиновых кислот ионизирующим излучением. Облученную ДНК инкубируют в полной ДНК-полимеразной (или РНК-полимеразной) системе, содержащей меченные рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, а затем измеряют индекс метки в кислотонерастворимой (полимерной) фракции.
3.2.4. Способность ДНК к образованию гибридов с мРНК
Способность ДНК к образованию гибридов с мРНК также позволяет количественно оценить инактивацию ДНК в результате облучения. Для проведения такого эксперимента при помощи матричного синтеза
134
Гл. IV. Прямое действие ионизирующих излучений
на ДНК получают РНК, меченную радиоактивным фосфором. Затем ее смешивают с предварительно облученной порцией той же ДНК и инкубируют смесь в определенных условиях. В ряде опытов изучали торможение образования гибридов ДНК-РНК после рентгеновского облучения ДНК из E.coli Б {препарат мРНК выделяли из того же объекта). Молекула мРНК воспринимала ДНК как «комплементарную», даже если она уже содержала несколько индуцированных излучением повреждений; только после накопления определенного числа повреждений способность облученной ДНК образовывать гибриды с мРНК резко понижалась.
3.2.5. Способность транспортных РНК связывать
соответствующие аминокислоты
Способность транспортных РНК связывать соответствующие аминокислоты можно оценить в специальных модельных системах и, таким образом, количественно оценить их инактивацию ионизирующими излучениями. Для этого препарат тРНК облучают и инкубируют с аминокислотами, мечеными по углероду 14С. Затем тРНК осаждают и в кислотонерастворимой фракции определяют содержание меченых аминокислот. Результаты такого эксперимента приведены в табл. IV.2. Относительную радиочувствительность различных тРНК оценивали по величине дозы D-^. Наиболее радиочувствительной оказалась лейциновая тРНК.
Таблица IV.2. Сравнительная радиочувствительность различных тРНК (по способности связывать соответствующие аминокислоты)
Изученный комплекс: ?>зт х 104, Изученный комплекс: Г>37 х 104,
аминокислота /тР НК Гр аминокислота /тР НК Гр
лейцин 25 пролин 58
аланин 43 метионин 62
изолейцин 46 валин 86
Кривые «доза-эффект» для радиационной инактивации тРНК представлены на рис. IV.5, из которого видно, что доля молекул, сохранивших способность связывать аминокислоты, экспоненциально убывает с ростом поглощенной дозы излучения.
3.2.6. Функциональная активность рибосом
Функциональная активность рибосом, облученных in vitro, оценивается по количеству белка, синтезированного в единицу времени в полной системе, содержащей соответствующие мРНК, тРНК и аминокислоты (рис. IV.6). Рибосомы выделяли из клеток Е. coli, облучали и инкубировали в системе, содержащей в качестве мРНК полиуридино-вую кислоту (поли-У), которая инициирует синтез полифенилаланина. Как видно из рис. IV.6, с ростом дозы облучения экспоненциально
3. Феноменологический анализ радиационного повреждения
135
Доза облучения, х 105 Гр
Рис. IV.5. Инактивация сухих препаратов тРНК электронами с энергией 1 МэВ. 1, 2, 3, 4, 5, 6 — соответственно комплексы лейцина, аланина, изолейцина, прсшина, метионина и валина со специфическими для каждого из них тРНК
