Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) - Кудряшов Ю.Б.
ISBN 5-9221-0388-1
Скачать (прямая ссылка):
макромолекул
Прямое действие ионизирующей радиации на макромолекулы обычно исследуют на обезвоженных или кристаллических препаратах ферментов и нуклеиновых кислот. В этом случае большинство
3. Феноменологический анализ радиационного повреждения_______129
молекул инактивируется в результате прямого поглощения энергии излучения *).
3.1. Прямое действие излучения на ферменты
Схема эксперимента по определению числа инактивированных молекул фермента при действии излучения в данной дозе состоит в том, что ампулу с гомогенным препаратом (сухим или кристаллическим) подвергают облучению, а затем сопоставляют активность опытного и контрольного образцов. Путем соответствующего пересчета можно перейти от доли инактивированных молекул (или процента инактивации) к истинному числу молекул фермента, инактивированных излучением в данной дозе. Используя соответствующие биохимические методы, можно оценить изменение различных функциональных свойств облученного фермента — каталитической активности, субстратной специфичности, стерического регулирования и т. д.
На рис. IV. 1, а, б представлены результаты одного из экспериментов Юнга и Дертингера с кристаллической рибонуклеазой. В широком диапазоне доз излучения оценивается каталитическая активность и субстратная специфичность облученного фермента.
Так как деградация РНК под действием рибонуклеазы осуществляется в два этапа (вначале расщепляется фосфодиэфирная связь в РНК и образуется циклический диэфир, а на второй стадии фосфатная связь гидролизуется до нуклеотид-3-фосфата), то, используя РНК в качестве субстрата, можно исследовать суммарную реакцию, а с помощью цитидин-2', 3-циклофосфата — только вторую ее стадию.
Рис. IV.1. Инактивация РНКазы 7-излучением. Ферментная активность определялась для двух различных субстратов: 1 — РНК; 2 — цитидин-2', 3'-циклофосфата; а) зависимость «доза-эффект» выражена в линейных координатах; б) эти же данные представлены в полулогарифмическом виде, экспериментальные точки
укладываются на прямую
*) Следует все же оговориться, что даже при облучении высокоочи-щенных препаратов в глубоком вакууме наличие одного только прямого действия маловероятно: активные продукты, возникающие при поражении одних молекул, могут индуцировать структурные изменения в молекулах ближайшего окружения.
5 Ю. Б. Кудряшоп
130
Гл. IV. Прямое действие ионизирующих излучений
Одинаковую радиационную инактивацию РНКазы наблюдали при использовании обоих субстратов (рис. IV. 1), т.е. при облучении в равной мере поражаются обе функциональные единицы фермента.
Зависимость эффекта от дозы облучения экспоненциальна. При самых малых дозах обнаруживаются молекулы фермента, утратившие способность расщеплять субстраты обоих типов; с ростом поглощенной дозы число таких молекул возрастает вначале резко, почти линейно, а затем мы видим, как значительному приращению дозы соответствует лишь небольшое увеличение доли инактивированных молекул. Для проверки экспоненциального характера зависимости «доза-эффект* необходимо преобразовать кривую IV. 1, а, построив ее в полулогарифмических координатах, как это сделано на рис. IV. 1, б (по оси ординат откладывается не доля молекул, сохранивших исходную активность, а натуральный логарифм этой величины). Все экспериментальные точки укладываются на прямую, проходящую под углом к оси ординат, следовательно, InN/No = —kD или N/No = e~kD (см. уравнение (III.9)).
Экспоненциальная зависимость «доза-эффект» обнаружена в экспериментах по лучевой инактивации различных ферментов (рис. IV.2)
и может рассматриваться как общая закономерность прямого действия радиации на ферменты.
Сравнивая кривые «доза-эффект», можно сопоставить радиочувствительность различных ферментов. Из рис. IV.2 видно, что для получения сравнимой инактивации изученных ферментов требуются существенно различающиеся дозы. Обычно в качестве критерия радиочувствительности выбирают такую дозу излучения, которая необходима для инактивации 63% молекул в облученном препарате фермента. Так как при этом 37% молекул сохраняют нативные свойства, эта доза получила название «доза 37%-ой сохранности», или доза Z?37. По рис. IV.2 можно установить, что для инвертазы Дч? в данных условиях составляет около 80 кГр, а для рибонуклеазы — 280 кГр, т. е. при одинаковой дозе молекулы первого фермента поражаются со значительно большей вероятностью. Это может быть связано с различными размерами макромолекулы, особенностями ее аминокислотного состава, характером миграции энергии в полимере или другими причинами, которые должны быть установлены в ходе биофизического анализа.
Известно, что функциональные свойства фермента определяются его различными структурными участками. Так как поглощение энергии излучения может приводить к различным типам структурного
?
а
S
г
«
I
1 (С
D. S
Я, s
•& н
и I
я
а й е Р
Я я
